基于滋味成分变化的祁门红茶发酵程度差异研究

刘亚芹，王 辉，杨霁虹，周汉琛，黄建琴，雷攀登

安徽省农业科学院 茶叶研究所，安徽 黄山 245000

祁门红茶色泽乌润、香气馥郁、滋味甜醇，是我国十大名茶之一[1]。祁门红茶的风味形成与工艺密切相关，其初制工艺为萎凋、揉捻、发酵和干燥，其中发酵是红茶色香味等品质形成的关键环节之一[2]。发酵是高温高湿下利用酶促作用使多酚类物质氧化及香气前体物质转化，从而达到红茶红汤红叶、甜香鲜醇的品质特征[3]。因此，探索祁门红茶发酵过程中关键滋味成分变化，是了解祁门红茶品质形成的重要途径。目前认为影响红茶滋味的主要物质有多酚类、氨基酸、咖啡碱、糖类和果胶物质等[1]；其中，在发酵过程中儿茶素是生化反应主体物质，而茶黄素是重要指标，对红茶茶汤醇厚度、鲜爽度及汤色亮度起着重要作用[4-6]。

红茶的发酵程度受多方面因素影响，主要基于人工经验来判断，缺乏客观性与科学性。目前，针对红茶发酵在适度判别方法等方面得到广泛研究。钱园凤[7]基于EGCG含量、Hab值建立决策树模型及颜玲[8]利用近红外光谱技术建立判别模型及YANG[9]根据高光谱和化学计量建立RF模型等，都有较好的预测效果。有学者认为，发酵叶叶色、汤色的色差Lab值和图像RGB值的变化可以作为红茶适度发酵判别的方法[10-12]。何华锋[13]根据发酵过程中香气的变化进行工夫红茶发酵适度的预测，发现5个单萜类香气组分与发酵适度相关性较显著。关于滋味成分与发酵适度的相关性也有相关研究。据研究，茶黄素可作为发酵程度的判断指标，茶黄素含量最高点即为发酵最适点[11,14]。桂安辉等[15]基于动态聚类分析认为，红茶发酵过程中儿茶素、茶黄素含量有变化规律，可作为发酵适度判别依据之一。

本研究拟通过感官审评判定不同红茶在制样品的发酵程度，对滋味成分氨基酸、儿茶素、咖啡碱、茶黄素进行测定，利用Dot值、OPLSDA模型和VIP值综合分析出区别红茶发酵程度的关键滋味成分。通过试验研究，以期为红茶适度发酵提供一个理论指标及参数指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

祁门红茶样品制备所用茶树品种为舒茶早（C. sinensis var. sinensis. cv Shuchazao）和凫早2 号（C. sinensis var. sinensis. cv Fuzao 2），来自安徽省农业科学院茶叶研究所试验基地的五年生茶树。鲜叶采摘时间2021年4月13日，采摘标准以一芽二叶初展为主，鲜叶重量约10 kg。没食子酸、咖啡碱、4种茶黄素、8种儿茶素标准品，上海源叶生物公司；茶氨酸标准品，北京百灵威科技有限公司；15种游离氨基酸标准品，德国Sykam公司。

1.2 仪器与设备

35型揉捻机和碧螺春烘干机，均为浙江上洋茶叶机械有限公司；C18色谱柱（1.9 μm，2.1*100 mm），美国沃特世科技有限公司；UltiMate 3000超高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；S-433D氨基酸分析仪，德国Sykam公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵样制备

发酵室温度25℃，相对湿度90% RH。发酵前 90 min，每 30 min 取样 1 次，之后每 15 min取样一次，直至195 min，共计取样11次。取样后进行干燥，磨粉后-80℃保存。

1.3.2 感官审评

参考国家标准GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》[16]，由经过培训且有高级评茶员及以上资质的5名人员组成审评小组，对不同发酵程度样品的滋味从青涩感与醇厚度两方面进行评价及判定。

1.3.3 茶黄素含量测定

前处理：称取0.2 g茶样，加入70%甲醇溶液5 mL，70℃水浴中浸提10 min，冷却至室温，3500 r/min 离心 10 min，上清液转移至 10 mL 容量瓶。残渣用70%甲醇溶液按以上操作重复提取一次，合并提取液定容至10 mL，摇匀。取上述提取液5 mL置于10 mL容量瓶中，用EDTA-抗坏血酸溶液定容，摇匀，过0.45 μm滤膜，待测。

检测条件：C18色谱柱，流动相：乙腈（20%），2%乙 酸（80%）； 流 速：0.2 mL/min，停止时间15 min。进样量5 μL；检测波长：380 nm；柱温：35℃。

1.3.4 儿茶素、没食子酸和咖啡碱含量测定

儿茶素、没食子酸前处理：称取0.2 g茶样，加 0.9 g 氯化镁及60 mL沸水，沸水浸提20 min，浸提完毕后趁热减压过滤，滤液移入100 mL容量瓶中，冷却后，用水定容，混匀，过膜，待测。

咖啡碱前处理：称取0.2 g茶样，加入5 mL沸水，70℃水浴浸提10 min，浸提后冷却至室温，3500 r/min 离心 10 min，将上清液转移至 10 mL容量瓶。残渣再重复提取一次，定容至10 mL容量瓶中，摇匀，过0.45 μm滤膜，待测。

检测条件：C18色谱柱，流动相：A相：2%乙酸；B相：乙腈。梯度洗脱条件：0 ～ 3 min（95%A），3 ～ 5 min（80%A），5 ～ 18 min（95%A），流速：0.2 mL/min。进样量 5 μL；检测波长：278 nm；柱温：35℃。

1.3.5 氨基酸含量测定

前处理：随机称取0.25 g磨碎茶样（约40目），装入茶包中，茶包封口后置于具塞25 mL三角瓶中，加8 mL沸水，90℃水浴8 min，倒出至25 mL容量瓶中，重复提取3次，定容至25 mL。每个样品平行提取3次。提取液稀释200倍，过0.45 μm滤膜，待测。

采用氨基酸分析仪测定待测样品中游离氨基酸组分含量，分析条件同周汉琛等[17]的方法。

1.4 数据分析

主要滋味成分的含量计算以各物质标准品的峰面积为横坐标、浓度为纵坐标作标准曲线，用样品的峰面积求出各组分含量，再换算出茶样中各组分的含量。单因素方差分析（ANOVA）LSD多重检验、Pearson相关性分析采用SPSS 22（IBM，美国）进行。正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）采用SIMCA 14.1软件（Umetrics，瑞典）进行。

2 结果与分析

2.1 发酵程度判定

根据感官评价，从青涩和醇厚感判定为三个等级，分别是发酵偏轻（青涩感明显）、发酵适宜（无青涩感，有醇厚度）和发酵偏重（无青涩感，醇厚度下降）。结果如表1所示，凫早2号茶样在发酵过程中从发酵开始到发酵105 min有青涩感，判定为“发酵偏轻”。从120 min后，滋味厚度增加，出现醇厚感，青涩感消失；发酵165 min时，滋味醇厚爽口，品质最佳，感官评价分值最高，发酵进程判定为“发酵适宜”。发酵180 min后，滋味变淡，醇厚度下降，此时发酵程度开始偏重。舒茶早茶样审评结果和凫早2号有相似规律：从发酵开始到105 min，滋味呈现“青涩感”，发酵120 min到165 min，滋味醇厚度增加，无青涩感，发酵适宜；其中在发酵135 min时滋味最好，品质得分最高。在发酵180 min时，滋味醇厚度减弱，发酵程度偏重。

表1 不同发酵程度茶样感官审评结果和分类Table 1 Sensory evaluation and classification of Keemun black tea with different fermentation levels

2.2 不同发酵程度茶样主要滋味成分变化

茶黄素是茶叶加工过程中形成的色素，也是红茶色素的主要成分之一。目前，已分离鉴定的茶黄素主要有12种，其中最主要的成分4种，分别为茶黄素（TF）、茶黄素-3-没食子酸酯（TF-3-G）、茶黄素-3’-没食子酸酯（TF-3’-G）和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯（TFDG）[18-19]。对不同发酵程度样品的茶黄素进行测定结果如图1：随着发酵程度的增加，舒茶早和凫早2号两个品种茶样的茶黄素总量稍有增加，分别从发酵偏轻（I）的8.65 mg/g和 4.10 mg/g增加到发酵过度（III）8.66 mg/g 和 5.52 mg/g。其中，TF和TF-3’-G含量降低，而TF-3-G和TFDG的含量呈增高趋势，与前人研究结果一致[20-21]。总体上，舒茶早比凫早2号的红茶在制品茶黄素含量高。凫早2号在制红茶样品中，与发酵偏轻（I）相比，TF-3-G的含量在发酵过度（III）时增加了43.75%，而TFDG增加了86.52%。

图1 主要滋味成分含量变化热图Figure 1 Heat map of changes in contents of major taste components

游离氨基酸是茶叶中的重要滋味成分，不同种类氨基酸的呈味属性有所差异。目前已经鉴定的氨基酸中，鲜味主要是茶氨酸（THE）、谷氨酸（GLU）、天冬氨酸（ASP），甜味是丙氨酸（ALA）、甘氨酸（GLY）和丝氨酸（SER），苦味是精氨酸（ARG）[22-23]。这些氨基酸也是茶汤中的主要氨基酸，占80%左右[24]。图1结果表明：随着发酵进程的增加，游离氨基酸总量总体上逐渐降低，与余鹏辉[25]、宫连瑾[26]等人研究结果类似。舒茶早和凫早2号两个品种，发酵偏重（III）茶样氨基酸总量分别为82.98 mg/g和80.23 mg/g，比发酵偏轻（I）分别降低31.2%和9.4%。不同发酵程度茶样中，发酵适度（II）茶样的氨基酸含量明显低于发酵偏轻（I）的茶样，舒茶早和凫早2号两个品种均有类似规律，而发酵偏重（III）茶样的氨基酸含量总体上稍低于发酵偏轻（I），且由表1可知，发酵偏重（III）茶样的爽口度弱于发酵适度（II）。

儿茶素是多酚类物质的主体成分，包括酯型儿茶素和非酯型儿茶素。儿茶素具有苦涩味，在红茶发酵过程中氧化形成有色氧化物[3,27]。对不同发酵程度样品的儿茶素含量进行测定，结果表明：舒茶早和凫早2号两个品种红茶在制品的儿茶素（酯型儿茶素和非酯型儿茶素）的含量随发酵进程显著下降，分别从36.78 mg/g和 18.52 mg/g 降至 13.51 mg/g 和 6.96 mg/g，且下降速度II快于III。儿茶素含量过高，茶汤浓苦，但儿茶素含量过低，茶汤浓度降低，汤感醇和。可见，茶汤中儿茶素含量不能过高或过低。

咖啡碱是茶叶重要的滋味成分，有苦味，但与茶黄素、茶红素缔合形成的复合物有鲜爽味[28]，此外，氨基酸能减弱其苦味强度，而茶多酚能增强其苦味强度[29]。图1的结果可看出，舒茶早红茶在制品在发酵进程中咖啡碱含量呈增加趋势，而凫早2号呈下降趋势，二者相反，但总体上咖啡碱含量较为稳定。

2.3 滋味成分贡献度

不同的滋味成分有不同的滋味属性，且对茶汤滋味的贡献大小不一。Dot值指某一滋味成分浓度与其阈值的比值，可以避免以滋味成分含量反映滋味贡献大小的问题，是评价滋味成分对样品贡献率的一种重要方法。若Dot值＞ 1，则表明该成分对茶汤滋味有显著贡献；反之，则贡献较小。Dot值越大其滋味贡献度越高[30-32]。

基于不同发酵程度在制品的主要滋味成分含量，通过文献查找各滋味成分的呈味阈值[32-33]，对所测样品进行滋味贡献度分析。由表2可知，不同茶树品种加工成的祁门红茶品质不一，贡献大小的滋味成分存在差异。凫早2号发酵在制品中的平均Dot值＞ 1的共有7种，TF-3-G、TFDG、TF、TF-3’-G、GA、CAF 和 EGCG；舒茶早中主要滋味贡献物质有4种，包括TF-3-G、TFDG、GA和CAF。可见，在凫早2号和舒茶早不同发酵程度在制品中，对呈味贡献大的共性物质主要有4种，即TF-3-G、TFDG、GA和CAF。

表2 祁门红茶主要滋味成分Dot值Table 2 Dot value of main flavor components in Keemun black tea

续表

2.4 影响发酵程度的潜在关键成分

为分析不同发酵程度的化合物的差异，以4个茶黄素组分、9个儿茶素组分、16个氨基酸组分及咖啡碱的DOT值作为变量，采用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）对不同发酵程度祁门红茶在制品进行聚类分析。如图2A和图2B所示，模型可有效地将凫早2号和舒茶早的不同发酵程度祁门红茶在制品区分为3个区域，凫早2号和舒茶早的这3个分区与感官品质的结果较为一致。发酵0 ～ 105 min为发酵程度偏轻，120 ～ 165 min 为发酵适宜，180 ～ 195 min为发酵偏重。

图2 OPLS-DA模型构建Figure 2 Model construction of OPLS-DA

此外，根据图2C和图2D，凫早2号和舒茶早的Q2回归直线与Y轴的截距分别是-0.51、-0.649，说明OPLS-DA判别模型不存在过拟合现象，模型较为可靠。

为了进一步筛选出影响这些结果的差异物质，针对三种发酵程度（I、II、III）类型进行VIP分析。一般认为物质的VIP值＞ 1，则说明该物质是影响较大的差异物质。结果（表3）发现，不同品种中影响发酵程度的滋味成分存在差 异。GA、TFDG、EGCG、TF-3-G、TF、TF-3’-G是区别凫早2号品种红茶发酵适度的重要化合物，而EGCG、ECG、GA、TFDG、TF、TF-3-G、EGC、TF-3’-G、CAF是区别舒茶早品种红茶发酵适度的重要化合物。其中共有的重要化合物是GA、TFDG、EGCG、TF-3-G、TF和TF-3’-G这6种滋味成分。

表3 基于OPLS-DA模型的差异物质VIP值分析Table 3 Analysis of VIP values of different substances based on OPLS-DA model

3 结论与讨论

对舒茶早和凫早2号两个茶树品种鲜叶加工祁门红茶不同发酵程度（发酵时间0 ～ 195 min）茶样进行感官审评的判定，将发酵程度分为发酵偏轻（I）、发酵适宜（II）及发酵偏重（III）3类。对不同发酵程度（I、II、III）茶样进行茶黄素、儿茶素、咖啡碱和氨基酸的测定结果发现，发酵进程中，茶黄素的总量稍有增加，儿茶素类物质剧烈降低，但降低速度越来越慢，这可能是由于儿茶素的下降与茶黄素的生成高度相关[34]。红茶发酵时，儿茶素与酶结合发生酶促氧化生成大量茶黄素类物质[35]，随着发酵的进行，多酚氧化酶的催化能力变弱及多酚类物质变少使得儿茶素类物质下降的趋势变缓。游离氨基酸类物质总体上减少，这可能是因为在发酵进程中氨基酸转化为其他物质，一是在酶的作用下产生了脱羧和脱氨作用，从而转化为芳香物质如醛、醇、酸等；二是氨基酸与多酚类、糖类结合形成醌、醛、酸、醇等物质；三是氨基酸与茶黄素及茶红素相互作用，形成深暗色的高聚合物[36-37]。在整个发酵过程中，发酵偏轻（I）茶样儿茶素含量较高，茶汤青涩；发酵适度（II）茶样儿茶素含量降低，茶黄素含量增加，形成茶汤醇厚爽口的品质。发酵偏重（III）茶样儿茶素保留量低，茶汤浓度降低，滋味醇和。

通过Dot值计算发现，THE和GLU都是所测样品中主要的鲜味氨基酸成分，在凫早2号和舒茶早所制红茶中，THE的含量高于GLU，但是Dot值相差5 ～ 8倍，这是由于THE阈值较大，导致对鲜味的贡献小于GLU。此外，凫早2号茶样中的TF-3’-G、GA、EGCG和舒茶早茶样中的TF-3-G、TFDG、GA、EGCG在某些在制品中Dot ＜ 1，推测这些物质可能是导致不同发酵程度红茶品质差异的重要物质。在凫早2号和舒茶早不同发酵程度在制品中，对呈味贡献大的共性物质主要有4种，分别是TF-3-G、TFDG、GA和CAF。进一步利用OPLSDA模型和VIP值分析，筛选到3种贡献差异物质，分别是GA、TFDG和TF-3-G，其中GA的贡献值大于其余茶黄素组分。Scharbert等[32,38]研究认为儿茶素是红茶茶汤涩味的主要来源，咖啡碱是红茶茶汤的苦味贡献者，但是茶黄素、氨基酸及有机酸等滋味单体对茶汤的涩味、鲜味及酸味没有显著贡献。这可能是因为茶汤中茶黄素、氨基酸等单体成分与其他物质如儿茶素的共同作用使茶汤呈现涩、鲜、酸的风味特征。桂安辉[12]采用方差分析研究发现，在“鸠坑种”工夫红茶发酵适度判别时，EC大于其他儿茶素组分，而儿茶素组分大于茶黄素组分。陈冬等[39]对3种优质祁门红茶的滋味特征分析结果表明，茶多酚、咖啡碱和游离氨基酸3个重要滋味成分存在显著差异，相关性分析证明祁门红茶的滋味是由多种成分共同作用的结果。

本试验结果梳理了不同发酵程度下红茶发酵滋味成分变化规律，同时筛选出区别红茶发酵程度的关键滋味成分，为红茶适度发酵提供一个理论指标，可对红茶生产实践具有指导意义。但试验茶树品种、滋味成分等不够丰富，成分间的相互作用不明确，研究尚存在不足。后续试验可丰富茶树品种及滋味成分，考虑不同成分间的相互作用，以更加全面解析红茶发酵过程中滋味成分的变化，筛选出贡献物质，更加精准地实现对红茶发酵适度的判别。