环状RNA在心血管疾病发病机制中的研究进展

薛拴勤，朱洁，陈丽君，高奋

(山西医科大学第二临床医学院，太原 030001；2山西医科大学第二医院心血管内科，太原 030001)

环状核糖核酸(circular ribose nucleic acid，circRNA)作为一种新型的非编码RNA，最初是在植物感染的病毒中发现，它是一种内源性共价闭合环形RNA分子。因为它的特殊结构，使其具备特异性(细胞类型、组织、发育阶段)、高稳定性和表达丰富性的特点[1]。研究表明，circRNA在心肌梗死(myocardial infarction，MI)[2]、动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)[3]、心力衰竭(heart failure，HF)等[4]心血管疾病的发病过程中扮演重要的角色。本文对circRNA在心血管疾病发病机制中的研究进展进行综述。

1 circRNA的生物发生

剪接机制长期以来被认为是环状RNA形成的主要过程。外显子序列的环状RNA由反向剪接产生，通过反向剪接形成的外显子环状RNA包括套索驱动模型和内含子配对驱动两种模型。当外显子circRNA从信使RNA前体中释放出来并保留内含子序列时，形成具有内含子序列的circRNAs(exon-intron circRNA，EIci RNA)，如果未保留内含子序列，便形成无内含子序列的环状外显子(exonic circRNA，ecircRNA)。通过规范剪接从内含子套索产生的circRNA被称为环状内含子RNA(circular intronic RNA，ciRNA)，因此最终成熟的circRNA分为EIci RNA、ecircRNA、ciRNA[5]。

2 circRNA的功能

(1)充当miRNA海绵：circRNA是构成竞争性内源性RNA的重要组成部分，并存在信使RNA的结合位点，因此能够充当miRNA的海绵并且抑制其靶基因的活性；(2)circRNA与RNA结合蛋白相互作用：circRNA是由RNA连接蛋白基因产生，并具有与宿主RNA连接蛋白保守的结合位点，因此circRNA可以与RNA结合蛋白相互作用来调控相关蛋白的功能；(3)调控基因表达：研究表明亲本基因的转录，受细胞核中EIciRNA的影响；另外circRNA的形成会影响前体信使RNA的线性剪接，最终影响信使RNA的表达；(4)编码蛋白质：circRNA具有内部核糖体进入位点，可以编码蛋白质。

3 环状RNA与心血管疾病

3.1 环状RNA与心肌梗死

心血管疾病是人类死亡的主要原因。在所有类型的心血管疾病中，MI死亡率最高。因此，抑制心肌细胞死亡是MI治疗的主要策略。circRNA作为一种新型的非编码RNA，也被报道与心肌梗死有关。

3.1.1 circRNA-Cdr1as 有研究利用大鼠MI模型，发现心肌组织中环状RNA小脑退化相关蛋白1反义转录物(circular RNA cerebellar degenerstion-ralatedprotein 1 antisense，circRNA-Cdr1as)和微小RNA-7a(microRNA 7a，miR-7a)的表达上调，Cdr1as通过与 miRNA-7a结合，使其靶基因信使RNA编码的刺激蛋白1(stimulatory protein 1，SP1)和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(polyadenosine diphosphate ribose polymerase，PARP)表达上调，可以促进细胞的凋亡，从而引发MI[2]。

3.1.2 线粒体裂变和细胞凋亡相关的circRNA 在缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation,A/R)的心肌细胞中，增加线粒体蛋白18(mitochondrial protein 18,MTP18)可促进A/R诱导线粒体裂变和心肌细胞的凋亡及缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)所导致MI的面积，还可抑制其靶基因微小RNA-652-3p(microRNA-652-3p,miR-652-3p)，进而加剧线粒体分裂和细胞凋亡[6]。为进一步验证调节miR-652-3p的circRNA，随机筛选了来自circRNA数据库中的circRNA，最终发现在A/R和I/R模型中线粒体裂变和细胞凋亡相关的circRNA(mitochondrial fission and apoptosis-related circRNAs，MFACR)明显增加[6]。因此，MFACR可能充当miR-652-3p的海绵，增加MTP18并介导MI中线粒体裂变和细胞凋亡。

3.1.3 心肌梗死相关的环状RNA 一项涉及642例急性MI患者的研究中发现，心肌梗死相关的环状RNA(myocardial infarction-associated circular RNA，MICRA)可作为心肌梗死患者左心室功能障碍发展的预测指标，外周血中MICRA低表达的患者具有较高的心室功能障碍风险[7]。尽管机制尚不清楚，但MICRA提供了一种新颖的方法来预测急性心肌梗死早期的左室功能障碍。

3.1.4 与自噬相关的环状RNA 自噬是参与各种心脏疾病的公认机制，自噬细胞死亡的抑制对缺血/再灌注引起的心肌梗死起重要的保护作用。与自噬相关的环状RNA(circular RNAs associated with autophagy，ACR)首次作为心肌梗死中的新型调节剂被发现，它可直接与DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b，Dnmt3b)结合，上调第10同源染色体丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1，Pink1)表达，并使具有序列相似性的家族65B成员(family with sequence similarity 65 member B，FAM65B))磷酸化，从而抑制MI心脏的自噬和细胞死亡[8]。这些表明，ACR/Pink1/FAM65B信号可能是MI的潜在治疗靶标。另外别自东等[9]研究表明，circ-SEC23A能通过微小RNA-30a(microRNA-30a，miR-30a)/程序性死亡受体1(programmed cell death-1，Beclin-1)通路诱导心肌细胞发生自噬而促进心肌细胞损伤。

3.1.5 circ-Ttc3 在缺血和缺氧损伤的心肌细胞中，环状RNA四三肽重复结构域3(circRNA Tetratricopeptide repeat domain 3，circ-Ttc3)的表达明显上调。在MI模型中，过表达circ-Ttc3能够充当微小RNA-15b(microRNA-15b，miR-15b)海绵并抑制其活性，导致Arl2基因表达增加，从而起到保护心肌细胞的作用[10]。可见circ-Ttc3在MI中起到保护作用，为其治疗提供了新的靶点。

3.1.6 circ-Nfix 研究表明，过表达的环状RNA核因子 1X型(circRNA Nuclear factor 1 X-type，circNfix)不仅促进Y盒结合蛋白1(Y-box binding protein 1，Ybx1)与神经前体细胞表达发育下调基因4的相互作用，并通过泛素化使Ybx1降解，从而抑制细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白B1的表达。同时它也可充当miR-214的海绵，以促进糖原合酶激酶3β的表达并抑制β连环蛋白的活性来促进心肌梗死后的心脏再生修复和功能恢复[11]。

3.1.7 circFndc3b 对MI后小鼠心脏中的circRNA进行分析，发现环状RNAⅢ型纤维连接蛋白域3b(circRNA Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 3b，circFndc3b)的表达明显下调。在缺血性心肌病患者的心脏组织中，人circFndc3b同源物表达也受到抑制。在心脏内皮细胞中，过表达的circFndc3b不仅增加了血管内皮生长因子-A的表达，还增强了它们的血管生成活性，最终减少了心肌细胞和内皮细胞的凋亡，因此circFndc3b对MI后心脏再生修复有益处[12]。

3.2 环状RNA与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化由脂质沉积在动脉壁的内皮下层开始，以巨噬细胞、树突状细胞和活化T细胞的炎症浸润为特征。

3.2.1 环状细胞周期依赖激酶抑制剂2B基因的反义非编码基因 环状细胞周期依赖激酶抑制剂2B基因的反义非编码基因(circular antisense noncoding RNA in the INK4 locus，circANRIL)可以与60S-核糖体前组装因子雌激素受体共同调节因子抗体同系物1结合，导致由核酸外切酶介导的核糖体前RNA加工受到影响，进而抑制核糖体的成熟[3]，引起p53激活，导致凋亡增加，同时使血管平滑肌细胞和巨噬细胞的增殖减少。因此，circANRIL可通过抑制动脉粥样硬化斑块中细胞的过度增殖来预防动脉粥样硬化[3]。

3.2.2 circ-0003204和circ-0003575 氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)是引起动脉粥样硬化的常见原因。Li等[13]研究ox-LDL诱导的人脐静脉內皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中的circRNA表达谱，发现has-circ-0003575明显上调，其上调可促进ox-LDL诱导的HUVEC的凋亡，促进HUVEC的增殖和迁移，并抑制HUVEC的血管生成能力。这些结果表明has-circ-0003575可能通过诱导细胞凋亡促进动脉粥样硬化[3]。此外，研究表明circ-0003204在ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells，HAEC)中上调，其过度表达抑制HAEC的增殖、迁移和血管形成。circ-0003204能够充当miR-370海绵来促进转化生长因子β Ⅱ型受体R2(transforming growth factor β receptor Ⅱ，TGFβR2)及其下游磷酸SMAD3的蛋白表达[3]。因此，circ-0003204可作为动脉粥样硬化中异位内皮失活的新型刺激剂。

3.2.3 cZNF292和has-circ-0010729 Boeckel等[14]研究在缺氧条件下，circRNA在HUVECs中的差异性表达，发现环状锌指结构域的转录因子292(circular zinc finger domain transcription factor 292，cZNF292)是缺氧调节中表达最高的circRNA。沉默cZNF292能够显著抑制球体发芽和管的形成，进而降低内皮细胞的增殖[3]。Dang等[15]研究缺氧条件下HUVECs的表达谱，发现has-circ-0010729的表达明显上调，它可能通过靶向miR-186/HIF-1a途径调节血管内皮的增殖和凋亡。以上均表明cZNF292和has-circ-0010729在缺氧条件下促进内皮细胞的增殖和迁移，从而促进动脉粥样硬化的形成。

3.2.4 circ-0010283 Ding等[16]结果表明，在ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)中，circ-0010283通过miR-370-3p调节高迁移率族蛋白1(high mobility group protein B1，HMGB1)的表达。实验表明circ-0010283能够充当miR-370-3p海绵的作用并抑制其活性，进而对VMSC活力和迁移起到抑制作用[16]。此外，在ox-LDL诱导的VSMC中，过表达的HMGB1对VSMC存活和迁移力具有促进作用。总之，在ox-LDL诱导的VSMC中，circ-0010283通过miR-370-3p/HMGB1轴调节细胞活力和迁移，进而影响了动脉粥样硬化的发生与发展。

3.2.5 环状脂蛋白受体6 miR-145是最早发现的富含VSMC的微小RNA，它可控制VSMC的功能、血管重塑和AS。环状脂蛋白受体6(circular lipoprotein receptor,circ-Lrp6)通过充当miR-145海绵的作用对血管平滑肌细胞的迁移、增殖、表型转化等进行调控，最终起到抗动脉粥样硬化发生的作用[17]。

3.2.6 circ-0076981 在胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport,RCT)中，三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)起着至关重要的作用。我们团队在前期实验中发现，在RAW264.7源性巨噬细胞中，ABCA1表达下降时，RCT受到明显影响，从而引起动脉粥样硬化的发生[18]。circ-0076981可通过抑制miR-33a、上调ABCA1的表达,降低细胞内脂质蓄积，从而抑制AS的发生[19]。

3.3 环状RNA与心肌纤维化

3.3.1 circRNA-010567 研究发现，糖尿病小鼠和经肾素血管紧张素Ⅱ(renin angiotensin Ⅱ，AngⅡ)处理的小鼠心肌中circRNA-010567的表达明显增加，它的上调能够抑制miR-141的表达，提高转化生长因子b1(transforming growth factor b1，TGF-b1)的表达，同时促进与纤维化相关蛋白的表达(如胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和α-平滑肌肌动蛋白)，由此可知circRNA-010567通过靶向miR-141/TGF-b1轴促进心肌纤维化[20]。

3.3.2 circRNA_000203 circRNA_000203能够充当miR-26b-5p的海绵来促进结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)和Ⅰ型胶原蛋a2(type Ⅰ collagen a2，Colla2)的表达，从而对心肌成纤维细胞产生纤维化作用[21]。

3.3.3 circHIPK3 Liu等[22]研究表明在低氧环境下，心脏成纤维细胞中环状同源与结合蛋白激酶3(circular homeodomain-interacting protein kinase 3，circHIPK3)的表达显著上调，作为内源性miR-152-3p海绵，它的过表达可促进心脏成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和TGF-β2表达的抑制作用。综上所述，circHIPK3通过靶向miR-152-3p/TGF-β2轴在心肌纤维化的发生与发展中起关键作用。

3.3.4 circ-100395 研究表明，心房颤动(atrial fibrillation,AF)患者心耳组织中circRNA-100395表达明显下调；circRNA-100395可充当miR-144-3p分子的海绵来发挥抑制心肌纤维化的作用[23]。

3.3.5 circNFIB 有研究报道，发生MI后及经TGF-β处理的心脏成纤维细胞中circNFIB的表达降低，可促进成纤维细胞增殖。circNFIB的过表达可减弱miR-433模拟物诱导的促增殖作用[24]。因此，circNFIB-miR-433轴可能代表了一种治疗纤维化疾病的新颖治疗方法。

3.4 环状RNA与心脏衰老

心肌细胞属于永久性细胞，它的个体寿命在很大程度上取决于其存活时间。因此随着心肌细胞的衰老人类的寿命也即将终止。

3.4.1 circ-Foxo3 环状蛋白质叉头盒家族中亚类O成员3(circular fork head box O3，circ-Foxo3)在小鼠和老年患者心脏组织中的表达显著上调。研究表明circ-Foxo3的高表达伴随着更多的细胞在DNA合成前期被保留下来，无法转变为DNA合成期，从而抑制细胞增殖和细胞周期进程[25]。circ-Foxo3能够通过阻止转录因子抗衰老蛋白分化抑制因子1(anti-aging protein inhibitor of differentiation 1，ID1)、细胞周期相关性转录因子(cell cycle associated transcription factor，E2F1)、粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)和缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α)转移到细胞核来促进心脏衰老[25]。

3.4.2 circ-ITCH Zhang等[26]研究表明，miR-17-5p是环状RNA-ITCH(circ-ITCH)的靶基因，在过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱导的大鼠心肌H9C2细胞中具有较高的表达，它的高表达可抑制细胞的活力，促进凋亡。Wnt/β-catenin信号通路的抑制可能启动H9C2细胞的损伤过程，可见circ-ITCH可通过抑制细胞凋亡来保护心肌细胞免受H2O2的伤害，而miR-17-5p则起相反作用，通过Wnt /β-catenin信号通路上调细胞凋亡并抑制细胞活力，从而促进心脏衰老[26]。

3.5 环状RNA与心肌病

心肌病是一组异质性心肌疾病，是由不同病因(遗传性病因较多见)引起的心肌病变导致心肌机械和(或)心电功能障碍，常表现为心室肥厚或扩张。

3.5.1 与扩张型心肌病相关的环状RNA 对人类心脏中缺乏核糖体的RNA进行circRNA分析，发现来源于肌联蛋白的环状RNA(titin circular RNA，TTN circRNA)高度表达，这些TTN circRNA可以动态调节扩张型心肌病。无RNA结合基序蛋白20(RNA-binding motif-free protein 20，RBM20)的小鼠中完全缺乏TTNcircRNA，并且在RBM20突变的心脏组织中TTN circRNA的表达受到严重损害[27]。因此，RMB20在扩张型心肌病中起着重要作用。另外，有研究报道在接受心脏移植的扩张型心肌病患者中，环状溶质载体家族8成员A1、环状染色质域解旋酶DNA结合蛋白7、环状失调蛋白10的表达升高，而环状热休克蛋白家族成员C6的表达降低[28]。

3.5.2 环状血管动蛋白样基因1和circArhgap12 研究发现，腹腔内注射环状血管动蛋白样基因1可减少心肌细胞的凋亡、肥大和纤维化，从而预防阿霉素诱发的心肌病[29]。Wang等[30]研究表明在阿霉素干预下，由Rho家族蛋白激活蛋白12(Rho GTPase activating protein 12，Arhgap12)基因编码的circRNA可以海绵化miR-135a-5p抑制剂，促进细胞凋亡和氧化应激，可见circRNA Arhgap12通过海绵miR-135a-5p调节阿霉素引起的心脏毒性。

3.6 环状RNA与心肌肥大及心力衰竭

3.6.1 心脏相关的circRNA miR-223作为一种内源性调节剂，可诱导心肌肥大和心力衰竭。miR-223的下游靶基因是含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis inhibitor with caspase-enriched domain，ARC)，Wang等[31]验证了心脏相关的circRNA可以直接与miR-223结合并作为内源性miR-223海绵体抑制miR-223的活性，从而导致ARC表达的增加，进而在心肌细胞肥大和凋亡中起保护作用。

3.6.2 circ-0062389 Zhang等[4]研究表明，沉默circ-0062389可显著降低转化生长因子β1和Smad 3(small mother against decapentapiegic 3，Smad3)蛋白的表达，其可通过调节转化生长因子Smad1/Smad3信号通路减轻心力衰竭大鼠心肌细胞的凋亡，有望成为治疗心力衰竭的新靶点。

3.6.3 circ-000203 研究表明，circ-000203可使miR-26b-5p，miR-140-3p海绵化以增加转录因子GATA结合蛋白4的表达，增强心肌肥大[32]。

3.7 环状RNA与心房颤动

Jiang等[33]比较了3例AF患者和3例健康人心脏组织中的环状RNA，发现537个上调的环状RNA和199个下调的环状RNA，在这些差异性表达的circRNA中发现8个上调的环状RNA和2个下调的环状RNA能够与房颤患者相关的miRNA相互作用，如has-circRNA-100612可以与hsa-miR-892a、hsa-miR-3149、hsa-miR-3171、hsa- miR-892a及hsa-miR-133b相互作用，其中hsa-miR-113b的靶基因是钾离子通道相互作用蛋白1、JPH2和β1肾上腺样受体。钾离子通道相互作用蛋白1与心脏传导有关；JPH2在肌浆网钙离子处理和调节兰尼碱受体钙离子通道中起重要作用；β1肾上腺样受体是心血管疾病药物治疗的有效靶点。

Zhang等[34]比较了正常人和房颤患者心脏中circRNA的表达，发现AF心房附件中20个上调的circRNA和3个下调的circRNA，另外竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)网络分析显示has-circ-0000075和has-circ-0082096通过TGF-β通路参与AF的发病机制[34]。此外Hu等[35]报道108种circRNA在风湿性心脏病和持续性AF患者中差异表达，这些circRNA的生物信息学研究揭示了5种信号通路与房颤进展相关，包括调节扩张型心肌病的信号通路、肥厚性心肌病的信号通路、调节干细胞多能性的信号通路、河马信号通路和TGF-β通路。

3.8 环状RNA与高血压

3.8.1 has-circ-0037911 有研究表明，与健康对照组相比，高血压患者has-circ-0037911的表达明显更高[36]，然而其调控功能和机制尚未研究。

3.8.2 has-circ-0105015 He等[37]研究表明，has-circ-0105015高表达是原发性高血压的重要危险因素。has-circ-0105015高表达联合has-miR-637低表达提示血管炎症或内皮功能障碍，有可能作为原发性高血压早期诊断的生物标志物。

3.8.3 circ-0001946 刘婉月等[38]研究表明，过表达circ-0001946与超重及焦虑的联合作用可以增加高血压的患病风险。

4 总 结

circRNA在心肌梗死、动脉粥样硬化、心肌纤维化等心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)的发展中发挥着重要的作用。心血管疾病在世界上具有最高的残疾率和死亡率，且发病越来越年轻化。迄今为止，各种生物标志物包括脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、心肌肌钙蛋白T/I(cTnT/I)以及肌酸激酶心肌带同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)等已被广泛用于诊断或预测CVD的发生风险。血清中环状RNA主要来自外泌体，不含外泌体的血清中环状RNA含量较低。此外，血小板中含有大量的环状RNA，不同采血方式会影响环状RNA的定量。因此，建立标准化的采血方式是保证心血管疾病诊断标志物准确性的前提，我们迫切需要建立标准化的采血方式，这对CVD患者的早期识别和治疗有很大帮助。