CRKP对头孢他啶-阿维巴坦的耐药性及碳青霉烯酶表型的分析*

吴海燕，孙 霞，张 锋，姜梅杰，张志军，曹身云△

1.青岛大学附属泰安市中心医院重症医学科，山东泰安 271000；2.滨州市妇幼保健院检验科，山东滨州 256600；3.青岛大学附属泰安市中心医院超声诊疗中心，山东泰安 271000；4.青岛大学附属泰安市中心医院检验科，山东泰安 271000

肺炎克雷伯菌(KP)是我国临床感染性疾病的第二大致病菌，可引起呼吸系统、泌尿系统和组织感染等[1]。近年来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)不断出现，且检出率呈迅速上升趋势，给人类健康造成严重威胁[2-3]。CRKP通常呈现泛耐药，仅有多黏菌素和替加环素敏感性较好，但由于药物不良反应等原因[4]，临床医生常无药可用。因此，迫切需要一种新的、有效的抗菌药物来治疗CRKP引起的感染。头孢他啶-阿维巴坦(CZA)是一种新型的β-内酰胺合剂，阿维巴坦能够抑制多种类型的β-内酰胺酶，保护头孢他啶的杀菌作用[5]，可用于治疗CRKP的感染[6]。由于该药在我国上市时间较短，对其耐药性的研究和报道较少，为此，本研究就CRKP对头孢他啶-阿维巴坦的耐药性及碳青霉烯酶表型进行分析，以期为临床治疗CRKP感染提供理论依据。

1 资料与方法

1.1菌株来源 本研究菌株来源为泰安市中心医院2020年6月1日至2021年12月31日从临床标本中分离培养出的100株非重复CRKP。CRKP定义为对亚胺培南、美罗培南或厄他培南中任何一种药物耐药的肺炎克雷伯菌[7]。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922。

1.2仪器与试剂 Autof ms1000全自动微生物质谱仪和巧克力平板为郑州安图生物有限公司产品。CZA纸片为英国Oxiod公司产品。CZA的E-test条为温州康泰生物科技有限公司产品，NG-Test CARBA5碳青霉烯酶检测试剂盒为复星诊断科技(上海)有限公司产品。

1.3方法

1.3.1菌株鉴定 细菌的分离培养严格按照《全国临床检验操作规程》第三版[8]进行。取巧克力平板纯化培养过夜的单个菌落采用Autof ms1000全自动质谱仪进行菌株鉴定。

1.3.2CZA药敏试验 CZA药敏试验首先采用纸片扩散法进行，抑菌圈直径≥21 mm为敏感，抑菌圈直径≤20 mm为耐药。对于抑菌圈直径在20～22 mm的细菌，由于纸片扩散法容易出现假敏感或假耐药，因此用CZA的E-test条进行复核[9]。药敏试验和结果判读参照2021年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)抗菌药物敏感性试验执行标准M100[9]。

1.3.3碳青霉烯酶表型检测 采用胶体金免疫层析法检测细菌所产碳青霉烯酶的表型[10-11]，具体试验方法和结果判读参照试剂盒说明书。将检测卡和提取缓冲液平衡至室温，滴入5滴(约150 μL)提取缓冲液于无菌EP管中。使用1 μL无菌接种环取巧克力平板纯培养过夜的细菌，在EP管管壁轻轻研磨，形成均匀的细菌混悬液。使用一次性移液管，吸取5滴(约100 μL)制备好的细菌混悬液，加入检测卡标记了“S”的标本孔中，室温放置15 min，读取结果。如果只有C线区域出现一条红线，说明标本中不含检测试剂盒所检测的5种碳青霉烯酶或碳青霉烯酶含量低于检测试剂盒的检测限，判读为阴性结果。如果在C线区域出现一条红线，并且在K、O、V、I、N线区域出现一条或者多条红线，判读为阳性结果。如果C线区域未出现红线，说明测试结果无效。

1.4统计学处理 CZA耐药率统计应用WHONET5.6软件，计数资料采用频数、率表示。参照2021年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)抗菌药物敏感性试验执行标准M100进行统计分析。

2 结 果

2.1CZA药敏试验结果 100株CRKP中对CZA耐药24株，敏感76株，CZA的耐药率为24%(24/100)。

2.2胶体金免疫层析法碳青霉烯酶结果 100株CRKP中，产KPC型碳青霉烯酶的73株(73%)，产NDM型碳青霉烯酶的10株(10%)，同时产KPC、NDM型碳青霉烯酶的12株(12%)，同时产IMP、NDM型碳青霉烯酶的1株(1%)，未检出碳青霉烯酶的4株(4%)。见图1、表1。

注：从左至右依次为产KPC、NDM、KPC+NDM、IMP+NDM型碳青霉烯酶。图1 胶体金免疫层析法碳青霉烯酶检测结果

表1 对CZA不同耐药性的CRKP碳青霉烯酶检测结果(n)

3 讨 论

2020年中国细菌耐药监测网结果显示，KP对亚胺培南和美罗培南的耐药率从2005年的3.0%和2.9%上升至2020年的23.2%和24.2%[12]。尤其是长期住院和住重症监护室的患者，CRKP的检出已不再罕见。CRKP对常用抗菌药物耐药率高，常呈现泛耐药，只有多黏菌素类和替加环素敏感性较好。但由于多黏菌素与较高的肾毒性风险相关，而且静脉使用可能对肺炎无效[9]。替加环素常规剂量使用时治疗效果不理想，高剂量使用时，副作用也随之增大，而且不适用于泌尿系感染[9]，导致临床常面临无药可用的境地[13]。因此，急需一种新型有效的抗菌药物来治疗CRKP导致的感染。CRKP对碳青霉烯类药物耐药的机制有：产碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失、主动外排系统活跃等。其中最主要的机制是产碳青霉烯酶，CRKP中常见的碳青霉烯酶有KPC、NDM、IMP、OXA、VIM等[14]。

CZA是美国食品和药品监督局第一个批准的用于治疗碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌所致感染的新型β-内酰胺合剂。CZA是三代头孢菌素头孢他啶和新型酶的抑制剂阿维巴坦相结合，其中阿维巴坦比传统的β-内酰胺酶抑制剂具有更高的分子活性，可以抑制多种类型分解头孢他啶的β-内酰胺酶，而保护头孢他啶的杀菌作用。阿维巴坦可以抑制的β-内酰胺酶包括A类酶(如KPC-2等)、C类酶和某些D类酶(主要是OX-48等)，但对B类金属酶无抑制作用，如NDM、IMP、VIM等[5,15]。阿维巴坦的作用机制与传统的β-内酰胺酶抑制剂有所不同，主要区别在于传统的β-内酰胺酶抑制剂在与β-内酰胺酶结合时，结构被破坏而失活；而阿维巴坦在与β-内酰胺酶共价结合的过程中不会被水解，经环合形成内酰胺环后，阿维巴坦的活性又可以恢复[5]。而且阿维巴坦不会诱导β-内酰胺酶产生[16]，这也是优于传统β-内酰胺酶的重要特点。CZA可用于治疗碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌所引起的医院获得性和呼吸机相关性细菌性肺炎、泌尿系感染、腹腔感染等疾病[5]，是治疗产KPC和OXA-48型碳青霉烯酶肠杆菌目细菌的最佳选择[16]。

本研究中CRKP对CZA的耐药率为24%(24/100)，高于周琴等[17]报道的成都地区16.67%的耐药率，与许晓波[18]的研究结果(24.8%)基本一致。本研究中对CZA耐药的CRKP有24株，其中产NDM型碳青霉烯酶的有10株，同时产KPC、NDM型碳青霉烯酶的有12株，同时产IMP、NDM型碳青霉烯酶的有1株，未检出碳青霉烯酶的1株；对CZA敏感的CRKP有76株，其中产KPC型碳青霉烯酶的73株，未检出碳青霉烯酶的3株。本研究中产KPC型碳青霉烯酶的CRKP对CZA的敏感率为100%(73/73)，而所有产NDM型碳青霉烯酶的CRKP对CZA的耐药率为100%(23/23)。因此，对于CRKP导致的感染，应首先明确细菌所产碳青霉烯酶的类型。当CRKP产KPC型碳青霉烯酶时，其对CZA的敏感性较好，可以选择用CZA来抗感染治疗；而当CRKP产NDM型碳青霉烯酶时，通常对CZA耐药，应避免使用CZA进行治疗。此外，对于产金属酶的CRKP选择CZA和氨曲南进行联合用药也有治疗成功的报道[19-20]。

本研究中CRKP以产KPC型碳青霉烯酶为主(占73%)，与相关文献报道一致[21]。4株CRKP未检出碳青霉烯酶，可能的原因有：该碳青霉烯检测试剂盒只能检测KPC、NDM、 IMP、VIM、OXA等五种常见的碳青霉烯酶表型，若细菌含有SME、IMI等不常见的碳青霉烯酶表型则无法检出；也可能是细菌存在除产生碳青霉烯酶以外的耐药机制，如膜孔蛋白缺失或突变使膜的通透性下降或主动外排系统活跃等。

综上所述，本院CRKP以产KPC型碳青霉烯酶为主，其次是同时产KPC、NDM型碳青霉烯酶及产NDM型碳青霉烯酶。CRKP产KPC型碳青霉烯酶时对CZA的敏感性较好，产NDM型碳青霉烯酶时对CZA的敏感性较差。因此对于CRKP导致的感染，首先要明确细菌所产碳青霉烯酶的表型，才能更好地指导临床合理使用抗菌药物。