9个广西常规香稻品种香味及香味基因变异类型分析

刘广林 李虎 吴子帅 罗群昌 李秋雯 朱其南 陈传华

（广西农业科学院 水稻研究所/广西水稻遗传育种重点实验室，南宁 530007；第一作者：350595613@qq.com；*通讯作者：chenchuanhua@gxaas.net）

随着生活水平的提高，消费者对优质稻米的需求不断扩大，并呈多样化。香米由于具有独特的香味，深受消费者青睐，其市场价格也比普通大米高出许多，这也为香稻研究和推广提供了更广阔的市场前景[1]。香味被认为是一种重要的稻米品质指标[2]，香味的遗传规律以及香味物质的研究已取得较大进展。多数研究者认为，香味是由位于水稻第8号染色体上1个隐性基因控制，研究证实是Badh2基因。Badh2基因全长1 509 bp，包含15个外显子和14个内含子，编码503个氨基酸。该基因在不同部位的缺失或插入会引起Badh2基因功能的丧失，导致产生米香物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP），从而使水稻表现为有香味[3]。目前发现，Badh2基因在不同的香稻品种中存在多种类型的突变，以第7外显子有1个8 bp的缺失和3个3 bp突变[4]最为常见，还有第4和第5外显子之间存在803 bp的缺失[5]、第12外显子处有1个3 bp的缺失[6]、第13外显子中插入3 bp[7]、第2外显子有1个7 bp的缺失[8]，以及5'UTR区3 bp的缺失[9]，这些变异类型已开发出Indel2[10]、In－Del4-5[5]、GRFM04[1]、FME12[6]、Indel13[7]、FMU1-2[9]等 功能标记。本研究利用这些功能标记对广西近年育成的9个香稻品种的香味基因变异类型进行鉴定，并对这些品种的香味进行测定，以为香稻品种的推广及其在育种中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以广西近年通过审定的9个常规香稻品种为试验材料。这9个品种均为籼稻品种，分别是八桂香、田东香、百香139、桂茉香1号、中广香1号、桂野丰、广粮香2号、桂香18、桂香99和广粮香占。非香对照品种为常规籼稻油占8号。所有参试品种均于2019年晚季播种在广西农业科学院水稻研究所同一试验大田中，每个品种种植5行，每行12株，株行距13 cm×23 cm。整个生长时期采用普通大田常规栽培管理，每个材料随机5株混合采样。

1.2 分子标记法鉴定香稻香味基因型

1.2.1 引物设计

等位基因Badh2-E2为Badh2基因第2外显子7 bp缺失，采用InDel2功能标记；Badh2-E4-5等位基因为第4～第5外显子803 bp缺失，采用inDel4-5功能标记；Badh2-E7等位基因为第7外显子8 bp缺失和3 bp突变，采用GRFM04功能标记；Badh2-E12为第12外显子处有1个3 bp的缺失，采用FME12功能标记；Badh2-E13等位基因为第13外显子3 bp插入，采用InDel13功能标记；Badh2-UTR等位基因为5'UTR区3 bp的缺失，采用FMU1-2功能标记。上述6个引物信息详见表1，均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 badh2基因引物序列信息表

1.2.2 PCR扩增及产物的检测

DNA提取采用CTAB法[11]，PCR扩增参照SHAO等[5]方法进行，PCR产物用8%垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用0.2%硝酸银快速染色观察拍照。

1.3 香味物质2-AP含量的测定

稻谷收获后晒干，委托华南农业大学农学院测定2-AP含量。具体方法如下：称取5 g研磨好的样品放入玻璃瓶，加入10 mL色谱纯二氯甲烷，盖上密封圈，拧紧瓶盖稍许震荡摇匀，放入注满水的超声波清洗机，40 kHz、40℃超声240 min。取出样品瓶冷却至室温，加适量无水亚硫酸钠后立即用2 mL菌注射器吸取上清液并通过有机型针头过滤膜（孔径0.22μm，13 mm）将上清液注入顶空样品瓶，加入2μL浓度为0.0917 g/L的2,4,6-三甲基嘧啶（TMP）作为内标物，立即采用岛津GC-MSQP2010plus型气相质谱联用仪进行气相质谱测定。色谱条件：色谱柱为SH-Rxi-5Sil MS，长度为30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25μm，柱温升温程序为：40℃保持1 min，以2℃/min的速率升温至65℃，保持1 min，然后以10℃/min的速率升温至220℃，载气为高纯氦气（纯度＞99.999%）；恒压不分流进样方式，进样量为2μL。质谱条件：电子轰击（EI）离子源，离子源温度为200℃，离子化能量为70eV，接口温度为250℃，四级杆温度为150℃，全扫描方式，扫描质量范围35-160m/z。

1.4 香味综合评分

稻谷收获后晒干，委托农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心检测，依据为NY/T 596-2002《香稻米》，主要评价供试样品稻米香味强度、香味风味、滞留度的强度和时间以及综合印象。稻米香味强度、香味风味鉴别方法：取稻米2 g放入125 mL细口具塞棕色玻璃瓶，加50 mL蒸馏水，盖上瓶盖后放入沸水浴15 min，移出玻璃瓶稍加冷却，轻轻摇晃，打开瓶盖，闭上嘴，用鼻子吸嗅蒸汽进行评价。香味滞留度和综合印象的鉴别方法：称10 g稻米样品于铝盒中，用清水搅拌淘洗，适量加水浸泡30 min，于蒸饭锅内加水加热至沸腾，再将加盖铝盒置于蒸屉上，继续加热并开始计时，蒸煮40 min后停止加热，焖10 min，打开盒盖，取出米饭少许放入口中，一边咀嚼一边在吸气过程中用鼻后嗅觉法进行评价。4项评分之和为样品的香味综合评分，以泰国香米为对照（85分）。香味综合评分＜60分的不能作为香稻米。

1.5 香味类型的鉴定

参考王冠军等[12]及NY/T596-2002《香稻米》的方法，并结合多年香味育种实践将水稻香味分为烤面包香型、爆米花香型、茉莉香型、芋头香型及莴苣香型。具体分类标准如下：烤面包香型具有烤面包和香锅巴的香味，香气怡人，香味纯厚；爆米花香型有清香味，香味纯正，比烤面包香型的香味轻快；茉莉香型有清香气味，且有轻微的香肥皂化香味，极少数人不乐于接受，如KDML105；芋头香型有芋头清香；莴苣香型有莴苣清香。稻谷收获后晒干，取170 g用小型精米机碾成精米，取稻米2 g放入125 mL细口具塞棕色玻璃瓶中，加50 mL蒸馏水，盖上瓶盖后放人沸水浴中15 min，移出玻璃瓶稍加冷却。评价前应先将盛有样品的棕色玻璃瓶轻轻摇晃，然后将瓶逐个打开，闭上嘴，用鼻子吸嗅蒸气，评价并记录每一种样品的香味类型。

2 结果与分析

2.1 9个广西香稻品种的香味及香味类型

从表2可见，9个品种中除桂野丰的香味类型为芋头香型外，其他8个品种均为爆米花类型；9个品种香味综合评分差异不大，在74～79分之间，均可判定为香稻品种；9个品种的2-AP含量在60～128μg/kg之间，均可判定为香稻品种。

表2 9个广西常规香稻品种的香味及香味类型

2.2 9个广西香稻品种香味基因变异类型

2.2.1 功能标记GRFM04的检测

以9份广西香稻品种和1份常规籼稻品种（非香对照）的基因组DNA为模板，利用Badh2基因功能标记GRFM04进行PC R扩增，PCR产物采用凝胶电泳进行检测。田东香、八桂香、百香139、中广香1号、桂野丰、桂香18、桂香99和广粮香占均能够扩增出201 bp带型，桂茉香1号及非香对照油占8号仅扩增出209 bp带型（图1），说明田东香等8个香稻品种在Badh2基因的第7外显子处存在1个8 bp的缺失片段和3 bp的突变，它们属于同一种香味基因的突变类型，而桂茉香1号不属于此种突变类型。

图1 9个香稻品种的GRFM04分子标记检测结果

2.2.2 功能标记FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13检测

以9份广西香稻品种和1份常规籼稻品种（非香对照）的基因组DNA为模板，利用Badh2基因功能标记FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13进行PC R扩增，PCR产物采用凝胶电泳分别检测。检测结果表明，利用Badh2基因功能标记FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13都只扩增出1条带，大小分别为163 bp（图2A）、107 bp（图2B）、1123 bp（图2C）、192 bp（图2D）和194 bp（图2E）的片段，说明这9个香稻品种在Badh2基因的5’UT R区和第2、4、5、12、13外显子处均不存在突变，它们都不属于这种香味基因突变类型。

图2 9个香稻品种的FMU1-2（A）、InDel2（B）、InDel4-5（C）、FME12（D）和InDel13（E）分子标记检测结果

3 讨论与结论

目前常用水稻香味表型鉴定方法有咀嚼法、热水法、氢氧化钾法和仪器测定法等。其中，咀嚼法、热水法、氢氧化钾法主要是通过嗅觉及味觉感官来鉴定，方法简单但速度慢，样品多时误差较大。现在用得较多的仪器测定法主要是利用气相色谱仪测定2-AP含量[12]。本研究委托农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心对供试品种进行香味综合评分评定，委托华南农业大学农学院对供试品种香气的主要成分2-AP含量进行测定，香味综合评分主要通过感官法进行，2-AP含量测定属仪器测定法，两种方法在香与非香方面判定结果基本一致，感官法9个品种的香味评分均大于60分，仪器检测法均检测到2-AP的存在，两种方法均能判定9个供试品种为香稻品种；在香味浓淡方面，用感官法检测出各供试品种香味综合分数值在74～79分之间，差异不大；用仪器检测法检测到2-AP含量则在60～128μg/kg之间，含量最高的品种是最低品种的2倍左右。目前尚未有将2-AP含量与香味浓淡程度相互匹配的标准，无法判断人的感官对2-AP含量在60～128μg/kg之间的感知是否相近，这有待进一步研究。2-AP含量在水稻中很低，仪器能检测到的微小量而人的器官并不一定能感觉到，因此，仪器检测法对香味鉴定更有优势，但要鉴定香味的浓淡，仍需开展进一步研究，弄清人们能感受到浓香、香、微香所对应的2-AP含量范围，并制定相应的标准。

分子标记辅助选择能够有针对性的进行性状改良，进行多基因聚合，具有提高选择效率和缩短育种年限的明显优势[13]。由于香味为隐性基因控制的性状，且在香稻的杂合株型中，香味是以粒为单位分离，既有香粒，也有不香粒，利用标记检测还能有效避免含有香味基因的优良杂合个体在选择过程中被淘汰[14]，目前已有不少应用香型分子标记辅助选育出香型水稻新品种的报道[15-18]。弄清育种亲本的香味基因变异类型是开展香型分子标记辅助育种的关键。曾宇等[19]对179份广西特色香稻地方品种香味基因型进行鉴定，检测出InDel7等位基因类型40份、InDel4-5等位基因37份、InDel2等位基因1份，但该179份供试香稻材料多为地方粳糯稻品种。本研究中9个供试香稻品种均为广西生产上曾经或正在大面积推广的香稻品种，亦为广西香稻育种常用亲本，研究结果表明，八桂香等8个香稻品种为第7外显子缺失8 bp变异类型，这种基因型是香稻品种中最常见的变异类型。KOVACH等[20]对117个水稻品种进行检测，发现第7外显子缺失8 bp这种基因型占到被测样品的79.5%。针对这种变异类型 已 经 开 发 了GRFM04[2]、InDel7[10]、YY5-YY8[14]、PMFGR[21]多种功能标记，可利用现有的功能标记进行分子标记选择加快香稻新品种的选育进程。而桂茉香1号香味评分75分、2-AP含量74.83μg/kg，但却不属于本研究检测的6种Badh2基因变异类型，有可能是Badh2基因已经发现的其他变异类型或者是Badh2基因尚未发现的新等位基因类型，也有可能是新的香味基因，有待进一步研究。