环状RNA的研究现状及其与结直肠癌的相关性

宋伟 袁文正 任俊 付涛

环状RNA(circular RNA,circRNA)是由特定的反向剪接机制形成[1]。近年来，高通量RNA测序和生物信息学算法已经在真核生物中发现了数千种环状RNA，其中一些具有明确的生物功能[2]。与线性RNA不同，环状RNA不是由经典的剪接模式产生，而是通过反向剪接产生。虽然反向剪接的效率通常比线性剪接低，但是环状RNA具有很高的稳定性，可以以时间调节的方式在特定的细胞类型中累积[3]。此外，尽管环状RNA通常表达的水平低于其线性mRNA，但对于许多基因而言，环状RNA是主要的转录物[4]，这表明一些蛋白质编码基因的主要功能可能是产生环状RNA，而不是线性mRNA或蛋白质。环状RNA的生成有多种途径，常见形成机制包括剪接体介导的环化、内含子配对介导的环化及RNA结合蛋白介导的环化等[5-7]。研究表明，环状RNA具有多种功能，主要包括作为miRNA的海绵、与蛋白质相互作用、翻译功能以及调控亲本基因的转录[8-10]。

一、环状RNA在结直肠癌中的表达谱

RNA测序和环状RNA微阵列是环状RNA全基因组分析的最常用方法。环状RNA表达谱的鉴定是判定其作为促癌基因或抑癌基因的前提。结直肠癌(colorectal cancer,CRC)病人的组织、细胞、外泌体中已鉴定出数千种环状RNA。Zheng等[11]通过基因芯片分析10例结肠癌及癌旁组织中环状RNA的表达谱，共发现126个差异表达的环状RNA，其中有110个上调的环状RNA和16个下调的环状RNA。这些环状RNA大多位于外显子区域。Li等[12]通过对4对CRC及癌旁组织进行环状RNA测序，共测到21 458个环状RNA。经过P值和FC筛选后，鉴定出448个差异表达的环状RNA(394个上调环状RNA和54个下调环状RNA)，其中有15个环状RNA为首次发现的环状RNA。他们对其中10个在20对CRC组织中进行qRT-PCR验证。结果表明，circASPHD1、circHOMER1、circAPLP2、circVAPA和circTRAPPC9表达上调，circPRKAG2、circITFG2、circDDX17、circTRPM4和circLMF1表达下调，与测序结果一致。最后，通过对差异倍数最大的环状RNA并结合KEGG通路分析，将circDDX17作为候选基因，进行后续的功能研究。同样，Chen等[13]通过对CRC芯片分析发现38个环状RNA，挑选其中9个有统计学差异的环状RNA作为候选对象。在97例CRC病人的肿瘤及癌旁组织中进行验证，结果表明，circNSUN2在CRC组织中表达明显上调。此外，与没有淋巴结转移和正常对照的CRC病人相比，存在肝转移(liver metastasis,LM)的CRC病人血清中circNSUN2水平也明显升高。

研究表明，外泌体是传递miRNA、lncRNA、蛋白质以及环状RNA进行细胞间信号转导的载体[14]。Dou等[15]在三种结肠癌细胞系分泌的外泌体中检测到环状RNA，并且环状RNA在细胞外囊泡中比在细胞中更丰富。Xie等[16]通过对50份CRC和50份正常对照血清外泌体样品进行RNA序列分析，鉴定出1 924个CRC相关的环状RNA。根据FC和P值，共筛选出122个差异表达的环状RNA，包括100个上调的环状RNAs和22个下调的环状RNAs。

二、环状RNA与CRC发生发展的关系

有研究表明，环状RNA可以作为促癌或抑癌基因调控CRC细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。相关机制包括环状RNA作为miRNA海绵、与蛋白质结合以及编码多肽等。

1.环状RNA作为CRC致瘤基因：CiRS-7，也称为CDT1as，是由CDR1基因的反义转录物通过反向剪接而来。研究最多的是它作为miR-7的海绵功能。在CRC，ciRS-7通过拮抗miR-7介导的EGFR/RAF1/MAPK通路而发挥致癌作用。过表达ciRS-7可以抵消miR-7对CRC细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用，减少miR-7诱导的细胞凋亡。在体外，ciRS-7减弱了miR-7对EGFR和RAF1的抑制作用。同样，ciRS7也减弱了miR-7对Erk磷酸化的抑制作用。因此，证实ciRS-7-miR-7-EGFR/RAF1/MAPK调控轴在CRC进展中的作用[17]。同样，hsa_circ_101555通过hsa_circ_101555-miR-597-5p-CDK6/RPA3轴影响CRC的进展。hsa_circ_101555在CRC组织和细胞系表达升高，且与临床病理特征及预后相关。沉默hsa_circ_101555可以抑制CRC细胞的增殖、诱导其细胞周期停滞、细胞凋亡和DNA修复受损。进一步实验表明，hsa_circ_101555作为miR-597-5p内源竞争性RNA上调CDK6和RPA3的表达水平，从而促进CRC的进展[18]。CircHIPK3来源于HIPK3基因2号外显子，其剪切成熟序列长度为1099核苷酸。circHIPK3在CRC组织和细胞系中明显上调。敲低circHIPK3可以显著抑制CRC细胞的增殖、迁移、侵袭和诱导凋亡，且可以抑制体内CRC细胞的生长和转移。通过双荧光素酶报告实验和RNA pull-down实验证实circHIPK3作为miR-7的海绵。circHIPK3有效地逆转了miR-7对CRC细胞恶性表型的抑制。circHIPK3敲低联合miR-7过表达比单独敲低circHIPK3或过表达miR-7对肿瘤抑制的效果更好[19]。

环状RNA除了作为miRNA的海绵，还可以与蛋白质结合，甚至编码多肽。在CRC中，尤其是在有LM的CRC中，circNSUN2的表达水平升高。体内外实验表明，敲低circNSUN2可以明显抑制CRC细胞侵袭和迁移。RNA pull-down及RNA免疫共沉淀实验证明，circNSUN2的CAUCAU基序通过KH3-4双结构域与IGF2BP2蛋白结合。circNSUN2可以促进IGF2BP2与HMGA2 mRNA之间的相互作用，并通过circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白三元复合物的形成来增强HMGA2稳定性，促进CRC的转移[13]。CircPPP1R12A是由PPP1R12A基因24和25外显子反向剪接形成。过表达和敲低实验表明，circPPP1R12A在结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥了重要作用。通过生信分析预测，circPPP1R12A可以编码一个含有73氨基酸的蛋白质，实验证明，circPPP1R12A确实可以编码蛋白质。进一步体内外实验表明，circPPP1R12A-73aa可以促进结肠癌的增殖、迁移和侵袭。circPPP1R12A-73aa通过激活Hippo-YAP信号通路促进了结肠癌的生长和转移[11]。Zhi等[20]发现circLgr4在CRC组织中表达升高，且与非转移性肿瘤相比，转移性肿瘤circLgr4表达更高。敲低circLgr4可以抑制CRC干细胞的自我更新、CRC的发生和侵袭，而circLgr4过表达则起相反的作用。通过蛋白质免疫印迹和共聚焦检测等证实了circLgr4具有编码多肽的能力，且circLgr4编码多肽在肿瘤干细胞维持、自我更新和侵袭中起着至关重要的作用。circLgr4编码的多肽可以作用并激活Lgr4，从而进一步促进Wnt/β-catenin信号的激活。

2.环状RNA作为CRC抑癌基因：CircITGA7是由ITGA7第4外显子反向拼接形成。circITGA7在CRC组织及细胞系中表达下调，且与肿瘤大小、淋巴转移、远处转移和TNM分期相关。circITGA7过表达可以抑制CRC细胞增殖和转移，相反，敲低circITGA7可促进CRC细胞增殖和迁移。通过一系列实验证实，circITGA7通过吸附miR-370-3p，上调神经纤维蛋白1(NF1)抑制Ras信号通路。此外，他们还研究了circITGA7的上游机制，发现circITGA7可以通过Ras途径抑制RREB1，从而上调其宿主基因ITGA7的转录[21]。Shen等[22]发现沉默circ_0026344增加了CRC细胞的迁移和侵袭能力，并增加了上皮间质转化(EMT)过程，而过表达circ_0026344导致相反的结果。机制上，circ_0026344过表达可以明显下调Wnt/β-catenin途径中核心蛋白的表达水平，而miR-183 mmic可以逆转circ_0026344过表达对Wnt/β-catenin通路的抑制作用。circDDX17是由DDX17基因第2-8外显子构成，其长度约927碱基。circDDX17表达水平在CRC组织及细胞系中明显下调。体外实验表明，沉默circDDX17可以促进CRC细胞的增殖、迁移、侵袭及抑制细胞凋亡[12]。Jin等[23]表明hsa_circ_0000523在不同的CRC细胞系中表达下调。敲低hsa_circ_0000523可以促进CRC细胞的增殖和抑制其凋亡。hsa_circ_0000523通过海绵吸附miR-31 增加DDK1表达，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，抑制CRC的进展。

3.环状RNA可以作为CRC潜在的诊断和预后标志物：尽管环状RNA的研究尚处于起步阶段，但是环状RNA的一些特性表明它们可能是癌症和其他疾病的潜在有价值的生物标志物。首先，缺乏5＇或3＇末端使得环状RNA对RNase具有高度抗性。其次，它们通常以组织和发育阶段的特定方式表达，最后，它们在各种组织和体液中含量丰富，包括血液、尿液、外泌体，使其成为理想的液体活检生物标志物。

近年来，越来越多的研究表明，环状RNA可以作为CRC的诊断和预后标志物。Wang等[24]表明，hsa_circ_0000567在CRC组织中表达下调。hsa_circ_0000567 ROC曲线的AUC为0.865 3，其敏感性和特异性分别为0.833 3和0.764 7。此外，他们还发现CRC病人血液外泌体中的hsa_circ_0000567表达也下调了，表明hsa_circ_0000567可以作为CRC的诊断标志物。Pan等[25]发现，与正常人相比，CRC病人血清外泌体中hsa-circ-0004771表达明显升高,其AUC为0.88，其敏感性和特异性分别为80.91%和82.86%。在CRC术后病人的血清中观察到hsa-circ-0004771的表达下调了，表明hsa-circ-0004771可以作为CRC病人诊断标志物。Xu等[26]表明circRNA_0001178和circRNA_0000826在CRC肝转移组织中表达显著上调。ROC曲线表明，circRNA_0001178和circRNA_0000826的AUC分别为0.945和0.816，表明它们具有诊断结直肠癌肝转移的潜力。同样，Lin等[27]研究表明，三个环状RNA(circ-CCDC66、circ-ABCC1和circ-STIL)表达水平在CRC病人的血浆中均显著降低。ROC曲线显示，这一组环状RNA的AUC值为0.780，高于传统的癌胚抗原和糖类抗原19-9等蛋白质标志物。此外，将环状RNA与CEA和CA19-9结合使用可能会提高诊断CRC的能力(AUC=0.855)。Xie等[16]揭示，与对照组相比，CRC病人的血清外泌体中hsa_circ_0101802(circPNN)表达水平显着升高。ROC曲线表明，在实验队列和验证队列中的AUC分别为0.855和0.826，表明circPNN在诊断CRC中具有重要价值。此外，早期CRC血清外体circPNN的AUC为0.854，提示血清外体circPNN可能是CRC早期诊断的潜在生物标志物。

ciRS-7已被认为是多种肿瘤的诊断和预后标志物，包括结直肠癌。Weng等[17]表明ciRS-7在CRC中表达升高，且与肿瘤的分期、浸润的深度、淋巴结和远处转移及预后相关。单变量和多变量分析表明，ciRS-7是CRC独立预后因子。另一项研究表明，circHIPK3在CRC组织和细胞系中表达上调，过表达与肿瘤转移和进展分期相关。此外，多变量生存分析表明，circHIPK3高表达与CRC病人低总生存期密切相关，表明circHIPK3为CRC的独立预后因素[19]。Jin等[28]观察到CRC组织中hsa_circ_0005075的表达显着上调，多变量分析表明，hsa_circ_0005075高表达的CRC病人有着更短的总生存期和无病生存期。同样，Chen等[29]的研究表明，circ001971为CRC病人总生存期的独立因素，具有良好的预后能力(AUC=0.792)。

三、结论和展望

环状RNA参与CRC的各种生理和病理过程，包括增殖、凋亡、侵袭和迁移等。研究最多的功能是环状RNA可以作为miRNA的海绵，其他功能还包括与蛋白质作用、调控亲本基因的转录及翻译。此外，由于环状RNA本身的特性，环状RNA作为CRC诊断和预后的生物标志物，甚至新的治疗靶点具有巨大的潜力。越来越多的环状RNA研究已经揭示了环状RNA生物发生和调节的核心内容，但要了解这些分子在健康组织和疾病中的调控和功能，仍需要进行更加深入的功能研究。例如，在特定细胞类型中，尤其在单细胞水平上，确定空间和时间环状RNA的表达模式。此外，通过将过表达与CRISPR-Cas9敲除环状RNA结合起来，未来可能会发现更多环状RNA的功能。

综上所述，近几年环状RNA的研究为我们带来很多重大的发现，意味着环状RNA具有重要的生物学意义。随着RNA技术的稳步发展，进一步了解环状RNA定位、运输、降解、单细胞分析及环状RNA的表观修饰等可能是未来发展的方向。