超高效液相色谱串联质谱法测定土壤中农药残留

汤 莹

(实朴检测技术(上海)股份有限公司，上海 201108)

我国一直注重农业生产，农业生产中投入了大量农药，其对消除病虫害、铲除杂草、增加农业产量作出了极大的贡献[1-2]。然而，农药的使用给人类带来极大利益的同时也会带来很多副作用。绝大多数农药是有毒的化学物质，长期大量使用不仅对农副产品的安全、人畜的健康等形成潜在威胁，还会对环境造成污染。随着农药使用量的增加，土壤环境中残留的农药污染日益严重。对土壤进行农药分析检测是目前研究土壤、保护土壤安全唯一的确定方法。土壤中农药的残留浓度为痕量级，采用高效快速方便的方法检测土壤中的农药残留显得非常有必要[3-4]。

三环唑(tricyclazole)是防治稻瘟病专用杀菌剂，属于噻唑类，作为一种黑色素生物合成抑制剂，它可以通过抑制附着孢黑色素的生成，来抑制孢子萌发和附着孢形成，从而达到阻止病菌侵入或减少稻瘟病菌孢形成的目的；目前该农药已经在印度被禁用[5-7]。萎锈灵(carboxin)是一种具有内吸作用的杂环类杀菌剂，主要用于防治禾谷类作物黑穗病，其对人畜毒性较低，但不可与眼睛接触；经萎锈灵处理过的种子不可食用或饲用[8-10]。福美双(thiram)可作为内吸性杀菌剂复配剂的伴药，属二硫代氨基甲酸酯类保护性广谱杀菌剂，主要用于处理种子和土壤，防治禾谷类黑穗病和多种作物的苗期立枯病等[11-13]；该化合物属于欧盟内分泌干扰化学物质优先分类的第1类，已在28个国家禁用。唑螨酯(fenpyroximate)是一种高效、广谱、非内吸性的苯氧基吡唑类杀螨剂，广泛用于果蔬害螨防治，主要以触杀等作用方式达到杀螨的目的[14-15]。苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)是一种磺酰脲类除草剂，主要应用于水稻田等杂草防除，具有高效、低毒等特点，对于目标杂草如阔叶类杂草和莎草具有强烈的生长抑制作用[16-17]。实际应用中，水田和旱地相互轮作，因此这5种农药可能会在土壤和农作物中同时残留。同时分离检测三环唑、福美双、萎锈灵、唑螨酯和苄嘧磺隆的方法鲜见报道，因此该研究探讨并建立了同时测定土壤中三环唑、福美双、萎锈灵、唑螨酯和苄嘧磺隆的LC-MS/MS分析方法，以期满足土壤中三环唑、福美双、萎锈灵、唑螨酯和苄嘧磺隆的检测需求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器。Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪(美国Waters公司)；ME104E/02型电子天平(瑞士梅特勒公司)；SB25-12DT型实验室超声波式清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；TD5M离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；SK-1漩涡混合器(江苏中大仪器厂)；FilterUnit滤膜(0.22 μm,Agela Technologies公司)；Milli-Q超纯水机(Millipore公司)。

1.1.2试剂与药剂。三环唑、福美双、萎锈灵、唑螨酯和苄嘧磺隆，纯品型标准品，上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇、乙腈，均为高效液相色谱法级别，美国Thermo fisher公司；甲酸，质谱级，美国Thermo fisher公司；超纯水，Millipore公司；N-丙基乙二胺(PSA，40～63 μm，6 nm)，Agela Technologies公司；C18吸附剂，德国CNW公司；石墨化碳(GCB)，Agela Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1样品处理。称取10 g(精确至0.01 g)土壤样品至50 mL具塞聚丙烯离心管中，加入适量硅藻土研磨均匀，加10 mL乙腈涡旋振荡2 min，放置于超声波清洗机中超声20 min后，4 000 r/min离心3 min。取出离心管，取其上清液3 mL，加入至预先装有净化剂(300 mg无水硫酸镁、150 mg C18和150 mg PSA)的10 mL具塞离心管中，涡旋振荡2 min，8 000 r/min离心3 min后，过0.22 μm滤膜，待检测。

1.2.2标准溶液的配制。

1.2.2.1单一标准储备液。分别称取适量的5种农药标准品置于5个容量瓶中，用乙腈-水混合溶液(v/v=1/1)稀释定容至刻度，得到浓度为10 mg/L的各农药单一标准储备液。

1.2.2.2混合标准储备液。移取浓度为10 mg/L的5种单一农药标准储备液各1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈-水混合溶液(v/v=1/1)稀释定容至刻度，得到5种浓度均为1 mg/L的混合农药标准储备液。

1.2.2.3标准工作曲线测定。分别移取1 mg/L的混合农药标准储备液500、100、50、10、5、1 μL到6个10 mL容量瓶中，用乙腈-水混合溶液(v/v=1/1)定容，得到6个不同浓度的混合标准溶液，5种农药浓度分别是50.0、10.0、5.0、1.0、0.5和0.1 μg/L。

1.2.3仪器条件。色谱条件：选用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱温40 ℃；进样量1 μL；流动相为乙腈(A相)、0.1%甲酸水溶液(B相)，流动比例相梯度及流速情况见表1。质谱条件：扫描方式为正离子扫描模式(ESI+)；数据采集模式为多反应监测模式(MRM)。碰撞气体为氩气；脱溶剂气为高纯N2。化合物的监测离子对(m/z)、锥孔电压、碰撞能量等参数见表2。

表1 流动相梯度及流速

表2 5种农药的质谱分析条件

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1萃取溶剂的选择。理想的萃取溶剂可以将目标化合物有选择性地转移到溶剂中，不仅可以对目标化合物进行有效提取，还可以规避非目标化合物进入到萃取剂中，减少了样品基质的干扰。由于三环唑、福美双、萎锈灵、唑螨酯和苄嘧磺隆这5种农药有较大的物理化学性质差别，选用的萃取溶剂应对这5种化合物具有显著的溶解能力，并且对样品基质中其他的组分不溶或者少溶。该研究考察了丙酮、正己烷、乙酸乙酯和乙腈4种萃取溶剂，结果发现(表3)，当用丙酮作为萃取溶剂时，大部分农药的回收率在78.2%～90.2%，而萎锈灵的回收率为68.8%，回收率偏低；当用正己烷作为萃取溶剂时，三环唑的回收率为67.1%，唑螨酯的回收率为59.9%，苄嘧磺隆的回收率为65.6%，回收率偏低；当用乙酸乙酯和乙腈作为萃取溶剂时，回收率为78.5%～90.6%，总体表现较好，但乙酸乙酯作为萃取溶剂时，共提取物较多，杂质干扰较大，因此，选择乙腈作为萃取溶剂。

表3 萃取溶剂比较

2.1.2净化方式的选择。简单、快速的前处理净化方法有助于更准确地获得样品中农药的实际残留量。该试验中，土壤样品经萃取溶剂提取后，利用净化剂将提取液进行净化，净化后的溶液过0.22 μm滤膜后直接上机检测。净化剂由无水硫酸镁、PSA和C18组成，其中无水硫酸镁用于除去提取液中的水分。由于PSA粉末极易吸水，吸水之后对其他分子的吸附能力会显著下降，因此加入无水硫酸镁可以规避PSA因吸水而导致性能下降。PSA可以利用氢键吸附去除提取液中的极性化合物杂质，使样品达到净化。只加入无水硫酸镁和PSA时样品回收率较高，但基质中非极性杂质净化效果不好，故加入C18目的是去除部分脂溶性或其他非极性杂质。试验发现，采用300 mg无水硫酸镁、150 mg PSA和150 mg C18净化3 mL 土壤提取液，可有效去除基质中部分极性化合物、非极性脂肪和脂溶性杂质等共提物，保证净化效果并降低了后期质谱离子源等的维护成本。

2.1.3萃取方式的选择。该试验于空白的土壤样品中加入最终浓度为10 μg/L的混合标准溶液，以加标回收率为指标，考察振荡萃取法和超声萃取法对土壤样品中5种农药残留提取效率的影响，其他条件保持一致。振荡萃取采取的是将样品管固定在振荡器上振荡的方式。结果见表4。从表4可以看出，超声萃取法提取时5种农药提取效果更高。振荡萃取回收率低可能是因为在萃取过程中萃取液有一定的损失，萃取剂和溶剂未充分接触、振荡不充分等原因也有可能造成萃取率低。超声萃取可以使萃取剂和溶液充分接触，而且省时省力，能够同时处理多个样品。因此，该试验采用超声萃取法萃取样品。

表4 萃取方式比较

2.2 色谱质谱条件优化当采用乙腈-水作为流动相时，5种农药质谱响应较弱；采用乙腈-水(甲酸)作为流动相体系，目标物质得到了良好分离，质谱响应较强。该研究以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，对流动相的比例和洗脱梯度进行优化。结果表明，采用表1所示的流动相浓度和梯度洗脱条件可得到较好的峰形和分离效果。

利用5种农药浓度为1 mg/L的混合标准溶液，对三环唑、福美双、萎锈灵、唑螨酯和苄嘧磺隆的质谱参数进行优化，参数包括母离子和子离子、锥孔电压、碰撞能量、毛细管电压、脱溶剂温度和气体流量。试验结果表明，在ESI源正离子模式下，5种农药分子较易结合H+。质谱仪调谐，优化MRM参数使各农药特征碎片离子的强度达到最大。图1为参数优化后5种农药多离子反应检测总离子流图。

注：1.三环唑；2.福美双；3.萎锈灵；4.唑螨酯；5.苄嘧磺隆

2.3 线性关系考察按“1.2.3”色谱条件对5种农药进行测定，以峰面积对相应浓度进行线性回归。测定结果显示，在0.1～50.0 μg/L峰面积(Y)与样品浓度(X)呈良好的线性相关性(R2≥0.995)。按照HJ 168—2020计算检测方法的检出限和定量限。5种农药的线性回归方程、决定系数、检出限和定量限见表5，各目标分析物的检出限为0.009～0.022 μg/kg，定量限为0.038～0.088 μg/kg。

表5 5种农药的标准曲线、检出限和定量限

2.4 回收率与精密度试验以不含目标分析物的土壤样品作为空白样品，对该方法进行验证。考察了浓度为1和10 μg/kg的添加水平，使用已知浓度的混合标准样品溶液加入空白试样中，然后按照“1.2.1”的操作步骤进行提取、净化，重复试验6次。结果发现(表6)，该方法的加标回收率为71.9%～114.0%，相对标准偏差(RSD)为3.9%～8.3%，符合土壤实际检测的需求。

表6 5种农药的回收率和精密度(n=6)

2.5 实际样品分析利用该研究建立的方法，对45份土壤样品进行分析，结果见图2。采样区域内土壤中除福美双和萎锈灵外，其余农药检出率都比较低。福美双检出率最高，为95.6%，大部分土壤样品中福美双的检出量都较低，但有8批土壤样品福美双的含量较高，分别为11.43、13.71、14.92、30.29、34.31、57.34、59.70、75.84 μg/kg；萎锈灵检出率为86.7%，大多数土壤样品中萎锈灵检出量都较低，有4批土壤样品萎锈灵含量较高，分别为25.64、26.00、29.37、201.60 μg/kg。三环唑检出率为31.1%，检出量都比较低，最高的检测值为2.76 μg/kg；唑螨酯检出率为15.6%，检出量都比较低，最高的检测值为3.19 μg/kg；苄嘧磺隆未检出。

图2 土壤样品检出率

福美双和萎锈灵在采样地区使用较为频繁。三环唑、福美双、唑螨酯均有不同程度的检出，福美双的检出率更是达95.6%，说明该采样地区土壤存在较大的安全风险。

3 结论

该研究用高效液相色谱串联质谱法对土壤中三环唑、福美双、萎锈灵、唑螨酯和苄嘧磺隆进行同时测定。样品加入适量硅藻土研磨均匀后，经乙腈超声提取，离心分层并取上清液经吸附剂净化，以乙腈和0.1%乙酸水溶液梯度洗脱，利用ACQUITY UPLC BEH C18柱进行分离，正离子模式下多反应监测(MRM)扫描测定，实现了5种农药的分离和测定。该方法简单快速、试剂消耗少，能满足土壤中三环唑、福美双、萎锈灵、唑螨酯和苄嘧磺隆同时测定的要求，具有一定的应用价值。