内蒙古树木腐烂病病原菌的分子鉴定

刘 冰，张晴雨，杨晓坡

（1.赤峰学院 化学与生命科学学院；2.赤峰学院 教师教育学院，内蒙古 赤峰 024000）

树木腐烂病主要出现在树干、枝杈与枝条等结构部位，染病树木会出现干腐、树皮脱落等现象，直至树木死亡[1,2]。染病初期，树干上出现黄褐色的病斑并且树干表面失水、干裂、下陷。病斑后期逐渐扩大，出现针头状黑色突起。受雨水影响，黑色顶尖部位挤出分生孢子角，开始颜色为乳白色，之后变为橘红色，干燥后为琥珀色，形状呈长卷须状。染病树木的韧皮部呈黑褐色，表面有大量黑色的分生孢子器[3,4]。控制树木腐烂病的重点是预防，而明确病原菌的种类则是前提与根本[5]。引起树木腐烂病病原菌种类复杂多样，防治树木腐烂病具有一定的困难[6]。在经典的形态学鉴定过程中，由于缺乏DNA水平的检测和系统发育分析，物种的鉴定时常遭遇困境[7]。随着PCR技术、高通量测序技术、生物信息学等新兴领域发展，DNA条形码（DNA barcoding）技术因其不受菌物生长阶段形态学特征的影响并且能客观地鉴定物种而被广泛应用[8]。在DNA条形码中，真菌核糖体基因转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）的ITS1和ITS2作为非编码区与rDNA中的5.8S、18S、28S的基因组序列相比，受到较小的进化选择压力，变化相对较大，出现较高的种间差异，可为菌物分类鉴定提供遗传信息[9]。同时，核糖体大亚基（ribosonmal large subunit，LSU）可以帮助区分种间差异[10]。本文通过上述分子鉴定方法对一种内蒙古树木腐烂病病原菌的ITS与LSU进行序列分析，避免了自然环境的综合作用对腐烂病菌形态鉴定的影响，从而为内蒙古树木腐烂病病原菌的鉴定与防治奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

树木腐烂病引证标本（CFSZ 23606）是杨晓坡于2020年5月31日采自赤峰市松山区石博园，现保存于赤峰学院标本室（CFSZ），引证标本如图1所示。

图1 树木腐烂病的引证标本（CFSZ 23606）

1.2 病原菌分子鉴定

在已灭菌的载玻片中间滴上1μL提取液，用已灭菌的接种针挑取孢子堆置于载玻片上的提取液中。覆盖另一片载玻片，用外力将孢子挤压使孢子壁破裂，之后用600μL的提取液冲洗两片载玻片。将其移入1.5mL离心管中，用E.Z.N.A Fungal DNA Kit提取病原菌DNA。病原菌ITS序列PCR扩增引物采用Rust2inv（5’-GATGAAGAACACAGTGAAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），LSU序列PCR扩增引物采用CTB6（5’-GCATATCAATAAGCGGAGG-3’）和TW13（5’-GG TCCGTGTTTCAAGACG-3’）。PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。采用MEGA-X软件的邻接法（Neighbor-Joining method,NJ）构建系统发育树，构建ITS和LSU系统发育树所用的序列详见表1和表2。

表1 续

表1 构建ITS系统发育树所用的序列

表2 续

表2 构建LSU系统发育树所用的序列

3 结果与分析

3.1 病原菌CFSZ 23606 ITS和LSU序列的Blastn比对分析

病原菌CFSZ 23606的ITS序列（OP363712）经过Blastn比对得到的结果与产自美国的Cryp tosphaeria pullmanensis（KT425217）的序列相似率最高，为98.63%。CFSZ 23606的LSU序列（OP363713）经过Blastn比对得到的结果与产自美国寄生在Populus sp.上的Cryptosphaeria pullmanensis（KT4 25282）的序列相似率最高，为99.64%。

3.2 病原菌CFSZ 23606 ITS和LSU序列的系统发育分析

系统发育分析显示，CFSZ 23606的ITS序列（OP363712）与Cryptosphaeria pullmanensis（KT425 217、KT425226、KM588263、KX168606、KM588264、KM588265）聚为一支。CFSZ 23606的LSU序列（OP363713）与Cryptosphaeria pullmanensis（KT425 282、KT425288、KT425262、KT425293）聚为一支，如图2所示。

图2 内蒙古树木腐烂病病原菌（CFSZ 23606）的系统发育分析

综上所述，CFSZ 23606鉴定为普尔曼隐球壳Cryptosphaeria pullmanensis，属于子囊菌门Ascomycota、盘菌亚门Pezizomycotina、粪壳纲Sordariomycetes、碳角菌亚纲Xylariomycetidae、碳角菌目Xylariales、蕉孢壳科Diatrypaceae。

4 讨论

在经典形态学研究的基础之上，蓬勃发展的分子生物学技术极大地推进了现代分类学的发展，物种被描述的速度越来越快，分类学相关的概念也得到了进一步诠释。然而，对于物种的鉴定应采用各种分类性状进行综合分析，共同支撑分类学的研究，由此分子鉴定与形态鉴定的互证便显得尤为重要[11]。本研究的病原菌CFSZ 23606通过分子鉴定为Cryptosphaeria pullmanensis，与形态鉴定结果相吻合，进一步验证了鉴定结果的可靠性。