外泌体中环状RNA在癌症早期诊断中的研究进展

汪洁,苏丽清,黄淑铃,林晓婧,郑燕宁,李玉荷,伊雪

(厦门医学院 a.基础医学部，b.机能与临床转化福建省高校重点实验室，c.呼吸疾病研究所，福建 厦门 361023)

外泌体是一类由细胞释放的、具有脂质双层膜性结构的细胞外囊泡。其以细胞外分泌小泡的形式存在，该分泌形式可保护核酸类物质在血液中不被降解，增强了肿瘤细胞的治疗抵抗，为肿瘤细胞的信号传递提供载体和途径。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类不具有5′端帽子和3′端Poly(A)尾巴，以共价键形成的单链环状结构的非编码RNA，几乎存在于所有的物种中，且含量丰富。因其3′,5′-磷酸二酯键首尾相连，可耐受核酸外切酶降解，其比传统的线性RNA更具有稳定性[1]。circRNA多存在于血液、唾液、尿液等体液中，定位于细胞质或储存于外泌体，且在外泌体中与线性RNA的比例是细胞中的6倍[2]。表明外泌体circRNA有作为癌症早期诊断与筛查指标的潜能。现主要阐述外泌体circRNA的生物学功能及在癌症发生发展中的作用，探讨外泌体circRNA作为癌症早期诊断生物标志物的临床应用前景。

1 外泌体概述

外泌体是一类具有脂质双层膜性结构的细胞外囊泡，直径多为30～150 nm，密度为1.13～1.19 g/ml。最初被认为是细胞中的废物，以囊泡的形式排出体外，随着进一步研究发现外泌体能够携带蛋白质、核酸、脂质和糖等生物活性分子，并在细胞间传递重要信息[3]。外泌体体积微小、性质稳定，可自由穿过细胞外基质、血管壁等，广泛分布于血液、尿液、乳汁、唾液、脑脊液等体液中[4]。外泌体表面含有四跨膜蛋白家族中的CD9、CD63和CD81、膜联蛋白、上皮细胞黏附分子等特殊的膜蛋白，可作为检测外泌体的特异性标志物。在透射电子显微镜下外泌体的形态为杯托状或圆盘状[5]。

目前已经发现外泌体在肿瘤的发生、生长、转移和耐药中起着重要作用[6]。肿瘤细胞分泌的外泌体可使正常细胞发生转化，例如前列腺癌来源的外泌体能诱导脂肪干细胞发生致瘤性转化[7]，乳腺癌来源的外泌体可导致正常细胞中相关信使RNA(messenger RNA，mRNA)沉默,促进肿瘤的形成[8]；这些均与外泌体转运致癌蛋白、mRNA和微RNA(microRNA，miRNA/miR)相关。且不同来源的外泌体能促进肿瘤细胞增殖，Zhou等[9]研究发现，外泌体来源的miR-224-5p的过表达可通过抑制雄激素受体和介导上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)促进非小细胞肺癌的生长，诱导非小细胞肺癌的增殖。Lin等[10]发现,肝癌细胞分泌的外泌体中高表达的miR-210可转移到内皮细胞中,抑制内皮细胞Sma和Mad相关蛋白4、信号转导及转录活化因子6的表达,促进新生血管生成,提高肿瘤侵袭转移的能力。

2 circRNA的生物学功能及在癌症中的作用

2.1circRNA的生物学功能 circRNA是一类具有特殊环状结构且耐受核酸外切酶降解的非编码RNA，广泛存在于各种体液中。circRNA可以分为外显子环化形成的circRNA、内含子环化形成的circRNA及外显子-内含子circRNA[11]。目前已发现的circRNA大部分为外显子circRNA，主要定位于细胞质，而内含子circRNA和外显子-内含子circRNA主要定位于细胞核。

circRNA主要有4种生物学功能。①miRNA海绵作用：circRNA含有大量miRNA的结合位点，可作为miRNA分子海绵与miRNA结合，阻碍miRNA与mRNA靶点结合，降低miRNA的活性、抑制miRNA的功能，从而上调miRNA靶基因的表达，在疾病调控中发挥重要作用[12]。②调控蛋白结合：多种RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)参与RNA的剪切、稳定性调控以及mRNA的翻译。在没有circRNA时，RBP与mRNA结合，翻译大量蛋白质。由于circRNA分子序列上包含了特定的RBP结合位点，circRNA与RBP结合形成RNA蛋白复合物，从而抑制特定的RBP功能及亲本基因转录[13]。③翻译蛋白质：circRNA虽然属于非编码RNA，但也有部分circRNA可被核糖体翻译，并编码多肽，进而行使调控功能[14]。④调控基因转录：circRNA能够以RNA-RNA相互作用的方式与U1小核糖核蛋白结合，其中U1与RNA聚合酶Ⅱ形成复合物结合到转录因子IIH基因上[11]。circRNA通过调控RNA聚合酶Ⅱ的活性促进亲本基因的表达。已经有越来越多的circRNA在生物体中被发现，它们广泛地、多样地、保守地、稳定地存在于真核生物中，具有组织特异性、时序特异性和疾病特异性等特征，这些显著特征是其成为人类疾病生物标志物的前提。

2.2circRNA在癌症中的作用 circRNA是非编码RNA网络的一颗新星，随着对circRNA研究的不断深入，已经发现许多circRNA参与了肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡[15-17]。Han等[18]发现hsa_circRNA_0007874、hsa_circRNA_104135可通过海绵作用与促癌基因miR-9结合,促进p21的表达，抑制肝癌进展。Chen等[19]研究表明，circRNA NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2基因可通过与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2、高迁移率族蛋白A2 RNA形成蛋白质三元复合物，稳定高迁移率族蛋白A2 mRNA的稳定性，促进结直肠癌转移的进程。Van Der Steen等[20]通过对60例肺癌和非转化细胞系的研究制作了非小细胞肺癌的circRNA图谱，发现大量circRNA亚群与细胞增殖相关。Shangguan等[21]的研究发现，外显子circRNA circSLC25A16可以通过与miR-488-3p/缺氧诱导因子-1α结合，激活乳酸脱氢酶A，加速糖酵解与非小细胞肺癌细胞增殖。Liu等[22]发现hsa_circ_001783的高表达与乳腺癌的发生和进展呈正相关，敲除hsa_circ_001783抑制了乳腺癌细胞的进展，进一步分析发现hsa_circ_001783通过海绵作用与miR-200c-3p结合，调控乳腺癌细胞的增殖和转移。circRNA的显著特征和它的生物学功能使其具有成为疾病早期诊断及治疗靶点的潜能。

3 外泌体circRNA在癌症早期诊断的价值及相关机制

3.1外泌体circRNA在癌症早期诊断中的价值 Li等[2]已证实人血清外泌体中已鉴定出1 215个完整且稳定的circRNA，超过90%由外显子环化而来。目前对癌症的早期筛查主要通过影像学检查、肿瘤标志物检测及手术穿刺活检等方法。然而，影像学检查存在假阳性高及辐射暴露的缺点；肿瘤标志物检测具有较低的灵敏度和特异度；通过内镜等手术或穿刺方法进行组织病理学检查的准确率高，但其为有创检查，易对患者心理和生理造成创伤。外泌体circRNA能否作为一种灵敏、特异、创伤性小、不良反应少的癌症筛查手段是目前研究的重点方向。

外泌体形成过程中circRNA富集的机制尚不清楚。一种可能是circRNA在细胞质中丰富并且在其形成期间被动地包含在外泌体中，另一种可能是circRNA从细胞质中主动转移到外泌体。circRNA可通过外泌体转移到供体细胞和受体细胞之间作为信使来介导多种信号通路。肿瘤患者与正常健康人群体内外泌体circRNA存在差异性表达[23-24]，进一步表明肿瘤细胞来源的差异性外泌体circRNA有作为癌症检测生物标志物的潜能。

许多分子生物学技术已广泛应用于外泌体circRNA的检测，包括高通量测序、基因芯片、定量聚合酶链反应等[25-28]。基因芯片主要用于检测全基因组circRNA，其检出率非常高。高通量测序技术对于circRNA的检测主要是通过反向可变剪切接头序列，而这些测序片段只占转录组测序技术所有测序片段中很少部分，常规测序深度使许多丰度的circRNA被损失掉，因此高通量测序技术检出率较基因芯片技术低。而定量聚合酶链反应检测circRNA表达与差异分析是对高通量测序、芯片结果的有效补充和验证，能有效与线性RNA区分开来，可检测包括细胞、组织、血液和外泌体等多种样本中circRNA差异表达情况。

在消化道肿瘤中已经发现一些异常表达的外泌体circRNA，如结肠癌患者血浆外泌体hsa_circ_0004071[24]及血清外泌体circRNA同源域相互作用蛋白激酶3基因[29]与正常人相比有明显的差异性表达，且对结肠癌的诊断特异度及灵敏度均较高；早期胃癌患者血浆外泌体circ0065149较健康者明显降低，且其对早期胃癌的诊断特异度及灵敏度均高于传统的肿瘤标志物，如癌胚抗原、糖类抗原199、糖类抗原125[30]；在胰腺导管癌患者血浆外泌体中发现circRNA异亮氨酰转移RNA合成酶(isoleucyl-tRNA synthetase，IARS)基因明显上调，且circ-IARS可通过外泌体进入人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)并促进肿瘤的发生和转移[28]；circ-0000284在胆管癌细胞系、肿瘤组织和血浆外泌体中明显升高，并且circ-0000284的高表达增强胆管癌细胞在体内、体外的迁移、侵袭和增殖能力[31]，提示这些外泌体circRNA可作为消化道肿瘤早期诊断和转移的潜在生物学标志物。在泌尿生殖系统肿瘤的外泌体中也发现了具有差异性表达的circRNA。如circRNA蛋白质精氨酸甲基转移酶5在膀胱癌患者血清和尿液外泌体中的水平与临床分期、生存率及肿瘤转移显著相关，提示circRNA蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因可作为膀胱癌早期诊断及预后的生物标志物[27]。Xu等[32]从Ⅲ期子宫内膜腺癌患者中鉴定出275个差异性表达的circRNA，提示这些差异性表达的外泌体circRNA可能对子宫内膜癌的诊疗具有指导意义。在呼吸系统肿瘤方面，目前已经发现肺腺癌患者血浆外泌体中hsa_circ_0001492和hsa_circ_0001346在肺腺癌早期即出现明显上调[33]；这些结果均提示外泌体circRNA有作为癌症早期诊断候选标志物的潜能。

3.2外泌体circRNA促进癌症发生发展的机制

3.2.1调控EMT EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间充质表型细胞的生物学过程，具体表现为上皮细胞极性消失，失去与基底膜的连接，黏附能力下降，丧失上皮相关表型，同时获得了间充质细胞特性与表型的能力，如迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力。可出现细胞骨架及相关基因的改变，如上皮标志物上皮钙黏素的减少及间质标志物神经钙黏素和波形蛋白的表达增加，导致癌细胞间黏附性减弱，易于脱落和转移，增加肿瘤的侵袭和迁移[34]。Zhang等[35]发现，胃癌外泌体circRNA核受体相互作用蛋白1可作为miR-149-5p的海绵，通过蛋白激酶B1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路促进EMT，增加肿瘤的转移。Joseph等[36]研究显示，肝细胞生长因子受体MET途径可调节小泛素样调节剂活化酶E2和circRNA卷曲螺旋结构域66的表达，诱导表皮生长因子受体耐药，增加肺腺癌细胞的EMT和转移潜能。

3.2.2调控血管生成和内皮细胞通透性 肿瘤新生血管的形成提供了肿瘤细胞代谢和生长所需的氧气及营养物质，是肿瘤生长和转移的重要原因。肿瘤外泌体circRNA可增加血管内皮细胞的形成，诱导新生血管腔的形成，进而促进肿瘤细胞的远处转移。Huang等[37]发现肝癌外泌体circRNA-100338可与miR-141-3p相互作用，并通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，促进HUVECs血管形成能力和肝癌细胞的转移。Li等[28]发现，胰腺癌组织和其转移性疾病患者的血浆外泌体中circ-IARS基因表达明显上调。在胰腺癌中，circ-IARS通过胰腺癌细胞外泌体进入HUVECs，调控miR-122的表达，增加大鼠肉瘤病同源家族成员癌基因的活性，上调纤维状肌动蛋白的水平，降低了胞质紧密连接-1表达，增强内皮细胞通透性和局灶性黏附，促进肿瘤侵袭转移的能力。敲低circ-IARS后，大鼠肉瘤病同源家族成员癌基因活性降低和纤维状肌动蛋白表达量减少，HUVECs的通透性减弱，癌细胞侵袭能力减弱。

3.2.3调控肿瘤微环境 肿瘤微环境指肿瘤细胞生长的细胞环境，包含多种成分，如肿瘤细胞、生长因子、细胞外基质、蛋白酶等。研究发现肿瘤细胞在转移前会首先释放外泌体，外泌体被相应器官的受体细胞摄取后，可使原器官细胞的状态发生改变，营造一个适宜肿瘤生长的微环境，从而促进肿瘤细胞的转移[38-39]。马维东等[40]发现结直肠癌细胞中的circ_0044366能够通过外泌体转运至肿瘤相关成纤维细胞中，吸附miR-29b上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2的表达水平。MMP2可分解层粘连蛋白-5产生具有催化作用的可溶性片段，参与肿瘤的免疫过程，促进癌细胞的迁袭和转移。李豪等[41]发现黑色素瘤外泌体可通过诱导成纤维细胞MMP2、MMP9的表达,促进成纤维细胞侵袭能力。黑色素瘤释放的外泌体还能够刺激基质细胞产生胶原蛋白18、层粘连蛋白-5,并活化促分裂原活化的蛋白激酶、尿激酶,通过重构肿瘤微环境支持转移细胞的生长[42]。

3.2.4促进肿瘤细胞免疫逃逸 机体的免疫系统虽然有产生抗肿瘤免疫应答的能力，但是许多肿瘤仍能在机体内生长和增殖，说明肿瘤具有逃避宿主免疫系统的识别和攻击，使机体不能产生有效的抗肿瘤免疫应答的能力，即肿瘤免疫逃逸。郑乃盛等[43]体外用M2型巨噬细胞模拟肿瘤相关巨噬细胞，提取其外泌体与胃癌细胞共培养。结果发现摄取了基质蛋白2胞外域的胃癌细胞可减弱CD8阳性T细胞的杀伤作用，并可激活干扰素通路，增加胃癌细胞程序性死亡受体-配体1的表达，促进胃癌细胞的免疫逃逸。Wang等[44]发现circRNA-002178在患者的肺腺癌组织、癌细胞和外泌体以及血清中显著上调。进一步研究发现，circRNA-002178可以作为miR-34的海绵，通过外泌体进入CD8阳性T细胞中，增强癌细胞内程序性死亡受体1的表达，诱导T细胞衰竭。

3.2.5调控肿瘤化疗耐药 肿瘤耐药性是指化疗过程中，肿瘤细胞对化疗药物逐渐产生耐受性的现象。化疗耐药是影响肿瘤治疗的主要障碍之一。肿瘤细胞耐药的主要机制包括：①发生于细胞膜水平的耐药，如药物摄取减少和细胞表面蛋白(P糖蛋白或多药耐药相关蛋白等)外排增多，引起细胞内药物的绝对浓度降低。②抗肿瘤药物进入细胞后，在亚细胞水平发生再次分布引起的耐药，如进入细胞质中的药物被转运至外泌体囊泡中，从而隔绝药物作用，并以胞吐的方式排出细胞外。③发生在药物细胞内代谢过程的耐药，如药物降解加速，积蓄减少等；肿瘤通常依靠有氧糖酵解产生ATP来快速生长和化疗耐药。M2型丙酮酸激酶在催化糖酵解过程中起关键作用。Wang等[45]研究表明，外泌体ciRS-122通过竞争性结合miR-122，上调M2型丙酮酸激酶促进糖酵解，并与化疗耐药性呈正相关。④发生在细胞核水平的耐药，如药物靶点的改变、凋亡途径的阻滞、肿瘤干细胞或肿瘤微环境的改变等。Yao等[46]研究发现，在顺铂耐药的胃癌血清和细胞中，外泌体circRNA浆细胞瘤变异体易位1上调。抑制circRNA浆细胞瘤变异体易位1的表达，可提高胃癌对顺铂的敏感性。

4 小 结

尽管外泌体circRNA在癌症早期诊断中取得一定进展，但仍存在多方面的挑战和困难。虽然外泌体与体液有高亲和力，可通过携带circRNA将生物信息和物质转运到目标细胞，保护circRNA免受破坏；但是细胞通过外排外泌体小泡也增加了circRNA的清除，减少了circRNA的聚积，最终导致外泌体中circRNA丰度较低。其次，圆形构象和序列与线性mRNA对应物重叠，使得对circRNA表达和功能的精确评估具有挑战性。随着检测手段的不断改进，实验方法的改良和生物信息学算法的不断优化，相信外泌体circRNA将作为一种高灵敏度、高特异度、高稳定性、创伤小、不良反应少的新型生物标志物，在癌症早期诊断中发挥举足轻重的作用。