呼吸道微生态与呼吸系统疾病的研究进展

柳天宇，张杨，胡枭，张昊芃，王宋平

(1.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000； 2.西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，四川 泸州 646000)

微生态学是生命科学的分支，过去由于传统培养技术和检测技术的不足，人们对人体微生态的认知和研究有限。人体内肠道微生物群最为丰富，既往研究大多集中于肠道微生态，但随着各项技术的发展，呼吸道微生态的重要性逐渐被认识，其重要性得到明确。宏基因组16S核糖体RNA基因测序研究显示，支气管树中存在一种特征性的微生物菌群，且健康和哮喘状态下的微生物菌群存在差异，否定了下呼吸道无菌的传统认识，进一步拓宽了呼吸道微生态领域的研究[1]。呼吸道微生态通常处于动态平衡，当正常动态平衡被打破时，往往对机体，尤其是呼吸系统产生负面影响[2-5]。越来越多的研究显示，呼吸道微生态受体内外众多因素的影响，并与慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)、新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)、变应性鼻炎、哮喘等急慢性呼吸系统疾病密切相关[6-10]。但由于个体差异，众多研究结果的普适性不足，而生物聚类分析的分辨率较好，可能成为一种研究分析呼吸系统疾病的可行方法[11]。呼吸道微生态为研究呼吸系统疾病的发病机制及治疗提供了新思路[12-13]。现对呼吸道微生态的概况、研究方法、呼吸道微生态与呼吸系统疾病的相关性以及呼吸道微生态应用的研究进展予以综述。

1 呼吸道微生态概述

呼吸道微生态指人体呼吸道内正常定植的微生物群以呼吸道及代谢产物为生存环境，且微生物群之间或微生物群与宿主之间不断进行物质、能量、信息相互交流，最后形成相对稳定的生物系统。整个呼吸道均有微生物定植，且上呼吸道与下呼吸道的定植菌群相似，由于呼吸道黏膜纤毛会选择性清除部分微生物，故呼吸道不同部位的菌群种类和数量存在差异，上呼吸道的定植菌群数量更多。在健康人呼吸道内定植的主要菌群有厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门五大菌门，其中厚壁菌门为优势菌门[14]。呼吸道中菌群密度与多样性均随着与口咽部距离的增加而呈梯度式减少，且肺部微生物群的黏膜密度随着与中央气道距离的增加而降低[15]。

上呼吸道由鼻、口、咽及环状软骨以上喉部组成，健康人鼻部主要有葡萄球菌属、棒状杆菌属，鼻咽部存在大量的狡诈球菌属、嗜血杆菌属、链球菌属等，口腔以普雷沃菌、韦荣球菌属和链球菌为主，咽部有大量的奈瑟菌属、罗氏菌属，以及普氏菌属、韦荣球菌属、纤毛菌属等厌氧菌，可见，口咽部的特征性菌属为链球菌[16-17]。

下呼吸道包括环状软骨以下喉部、各级气管及肺泡。健康人下呼吸道的微生物群种类大多与上呼吸道一致，如葡萄球菌属、链球菌属、莫拉菌属等，但浓度较低且下呼吸道无棒状杆菌属、狡诈菌属等[18]。肺部主要有拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门定植，也有惠普尔养障体等特有菌群[15]。

呼吸道微生态呈动态变化，并不断进行着组分的迁徙、消除以及繁殖[19]。在生命初期，个体间微生物群定植情况存在较强的异质性和波动性，微生物群通过调节免疫反应，使机体产生一定的免疫耐受，使机体的疾病易感性发生变化。在机体成熟过程中，体内微生物群逐渐稳定，通常认为3～4岁后便趋于稳定。影响呼吸道微生物定植的因素有很多，不仅与固有部位的条件差异有关，还有分娩方式、喂养方式、生活环境、抗生素、肠-肺轴等。Bosch等[2]指出，剖宫产婴儿的呼吸道微生物群总体发育延迟，特别是与健康相关的共生菌群(如棒状杆菌)的定植减少，可能影响呼吸道的健康。此外，不同喂养方式新生儿呼吸道中的微生物亦不同，且大多认为母乳喂养对新生儿更有利，因此阴道分娩且母乳喂养新生儿的呼吸道微生物群可能最佳。由于胎膜、胎盘、脐带血中均有细菌检出，认为在分娩前可能已发生微生物定植，基于此，子宫内无菌环境的假说受到质疑。

近年来，环境污染(尤其是大气污染)与抗生素的广泛大量使用备受关注，环境污染和抗生素的使用导致菌群多样性发生改变，这可能增加了COPD、哮喘等呼吸系统疾病的病情变化风险[3,20]。使用抗生素建立的呼吸道菌群紊乱模型可为动物实验模型造模提供新策略[21]。胃肠道是人体最大的免疫器官，其中微生物菌群广泛分布，肠道菌群通过脂多糖、短链脂肪酸等影响机体免疫系统。肠-肺轴即肠道与肺部之间的免疫联系，对呼吸道微生态的影响较大，肠道菌群通过辅助性T细胞17等免疫细胞与多种细胞因子相关的信号通路影响肺部免疫反应，可通过肠-肺轴对呼吸道的感染和呼吸系统疾病的发生发展与治疗进行免疫调节[21-22]。已有研究证明，抗生素的使用以及喂养方式直接影响呼吸道菌群的早期定植，导致不同个体的双歧杆菌等肠道菌群定植存在明显差异性[23-24]。定植菌群的变化推动免疫和代谢变化，通过肠-肺轴影响呼吸道微生态。儿童早期接触多种微生物可降低哮喘等过敏性疾病的发病风险[25]。上呼吸道的健康易受外界因素影响，与外部环境持续接触的上呼吸道的微生物菌群动态变化范围更大。由于伦理因素的限制以及采样技术的不足等因素，目前仍缺乏对胎儿和新生儿下呼吸道的研究，现有研究大多存在样本量小等不足，故早期呼吸道微生态干预的相关研究十分必要，可能为预防新生儿呼吸系统疾病带来突破性启示。

2 呼吸道微生态的研究方法

2.1呼吸道标本采集方法 在呼吸道微生态的研究中，呼吸道标本的采集常用鼻咽拭子法、自然咳痰法、诱导痰法、经支气管镜采样法，其中鼻咽拭子法、自然咳痰法运用最广泛、最为简便，在统计学研究中最常用。诱导痰法指通过吸入雾化高渗盐水诱导痰液生成，并进一步分析痰液成分的方法，常用于哮喘气道炎症机制的研究。目前支气管镜技术已经很成熟，可在保证患者检查舒适度的前提下使用支气管镜采集呼吸道远端样本，提高了样本的可信度和研究结果的准确性，有助于下呼吸道微生态的研究。

2.2呼吸道微生物的检测方法 传统的菌群培养方法由于无法检出绝大部分呼吸道微生物而存在极大的局限性，而呼吸道微生态的不断深入研究得益于分子生物学技术的发展和广泛应用。目前，微生态研究常用DNA测序技术，其中16S核糖体DNA扩增子测序和宏基因组测序是呼吸道微生物测序研究的常用手段，DNA测序技术现已发展到第三代。第一代测序技术(如Sanger测序)通常可检测较长的DNA序列(700～1 000 bp)，且准确度高(99.999%)，高准确度足以识别属水平高于94%且物种水平高于97%的同源性[26-27]，但该方法需要数天时间使用大肠埃希菌构建克隆库，且不适用于大量DNA序列的测序。第二代测序(next generation sequencing，NGS)技术能够以99%以上的准确度快速评估大量碱基，但NGS测序的准确度由大量相对较短、质量较低的短序列的比对深度保证，所以NGS每个序列的准确度均可能低于Sanger方法[28]。NGS只能检测样本属水平，但是Sanger方法可检测所有种水平上的细菌分类。Yatera等[29]提出，首先采用NGS测定有关呼吸系统疾病的呼吸道微生物菌群，然后通过Sanger方法深入研究种水平的细菌信息。通过不同技术的优势互补获得更准确可信的实验结果。第三代测序可在单分子水平读取核苷酸序列，又称为单分子测序，主要有基于荧光测序原理的HeliScope、基于电信号的Nanopore和基于零模波导特性的PacBio。第三代测序的优势在于不需要通过聚合酶链反应扩增来降低污染率，且可读取的序列更长、可直接进行RNA测序以及测序速度更快、更便携。但目前第三代测序技术尚不成熟，仍存在未解决的技术难题，且费用较高，无法广泛普及。

DNA测序技术的更新促进了微生态研究的发展。但菌群与宿主细胞间的作用机制还需要进一步研究，对各种微生物信息的进一步剖析需要不断提高微生物的培养与纯化技术。目前，改良与创新的微生物培养技术不断增加，通过微生物共培养方法提高微生物培养率，可能是微生态研究的重要方向之一[30]。

3 呼吸道微生态与呼吸系统疾病

COPD、CF、鼻炎、哮喘和COVID-19等急慢性呼吸系统疾病已成为全球健康问题，呼吸道微生态各组分在呼吸系统疾病中的作用逐渐凸显，其具体机制尚未完全明确，但调控呼吸道微生态可能是防治呼吸系统疾病的措施之一。

3.1COPD COPD以慢性持续性气流受限为主要特征。COPD患者下呼吸道定植菌群以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门常见[6,31]。急性加重COPD患者气道微生态多样性明显下降，包括流感嗜血杆菌属、卡他莫拉菌属等常见变形菌门致病菌的比例升高，可能与COPD加重有关[4,32]。急性加重COPD患者与稳定期低危COPD患者呼吸道微生物群多样性的差异极小，而部分菌种丰度有所差异，COPD急性加重可能与部分菌群富集相关[6]。大部分COPD的急性加重与细菌和病毒感染有关，伴下呼吸道感染的急性加重COPD患者往往存在严重肺部损伤和多种呼吸道感染症状，下呼吸道感染是导致中重度COPD患者急性加重致死的主要原因。此外，不同季节COPD患者的呼吸道微生态有明显差异，冬季患者呼吸道菌群多样性更高，且优势菌群与夏季不同，这可能与不同季节的气温以及空气中颗粒物数量(即空气污染程度)的差异有关[3]。目前的部分研究也说明，微生物通过多种途径介导影响COPD的发展与转归。Short等[33]认为，流感嗜血杆菌通过形成生物膜逃避宿主免疫系统影响抗微生物治疗的效果。Kaur和Batra[34]对模拟急性加重COPD体外研究模型的研究发现，COPD加重组白细胞介素(interleukin，IL)-8、单核细胞趋化蛋白1、IL-6、CC趋化因子配体5水平显著升高，核因子κB介导通路基因的低甲基化与细菌脂多糖的诱导相关。COPD患者的常见呼吸道菌群定植情况与健康人基本一致，但部分菌群生物量和致病微生物数量存在明显变化，如流感嗜血杆菌。不同炎症因子对各微生物菌群的影响可能不同，但其具体影响还需要进行针对性研究。呼吸道微生态与COPD密切相关，部分致病微生物通过自我保护机制造成菌群失调，并调节机体免疫系统，深入研究菌群紊乱影响COPD发病的潜在机制将为预防和治疗呼吸系统疾病提供新思路。

3.2CF CF是一种由CF编码跨膜传导调节因子(一种阴离子通道)基因突变所致的常染色体隐性遗传病，近年我国的CF诊断率逐渐升高。在CF相关阻塞性肺病中，厚而黏稠的痰液常堵塞气道，故机会致病菌持续存在，使气道易受到慢性细菌感染，进而发生严重的炎症反应，导致进行性气道组织损伤、肺功能下降，甚至导致患者死亡[7]。CF患者的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的慢性感染率最高[35]。除细菌外，白色念珠菌和烟曲霉等真菌以及鼻病毒和呼吸道合胞病毒等病毒通常也存在于CF气道中，当细菌与病毒合并感染呼吸道时，病情更严重[36]。但CF患者气道中的真菌菌群丰度存在高度波动，表明真菌的存在很可能是吸入，而不是定植[37]。

CF的肺部微生物组在患者之间以及患者内部高度可变，微生物组多样性随年龄而变化，通常年轻患者的微生物组呈高度多样性，而老年患者微生物组的多样性较低[38-39]。铜绿假单胞菌慢性感染是导致CF肺部微生态失调的原因[40]。CF患者的细菌耐药性随着抗生素治疗周期的延长而增加，并限制了抗生素的疗效[41]。此外，生物膜的存在使抗生素无法穿透生物膜并有效作用于代谢休眠表型的细菌。Khanolkar等[42]提出的CF生态演替模型强调了重要种群间的潜在相互作用，这可能解释了针对主要病原体治疗的效果常低于基于体外试验的预测效果的原因。因此，呼吸道微生态的调控可能是研究传统抗生素疗法替代方案的方向。

3.3COVID-19 COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)2引起的病毒性肺炎。已有研究显示，与SARS-CoV相似，SARS-CoV-2通过与血管紧张素转换酶2结合进入人体，引起大量细胞因子释放，多种免疫细胞参与炎症应答，而 Ⅱ 型肺泡上皮细胞中血管紧张素转换酶2呈高表达[43]。SARS-CoV-2与病毒、细菌、真菌等微生物的共感染是COVID-19的重要因素。病毒易破坏人体免疫系统，故SARS-CoV-2与其他病毒、细菌、真菌等微生物共感染后，往往病情更严重且更复杂[44-45]。在所有患者中，危重症患者的细菌和真菌合并感染占比更高，且合并感染菌群种类更多，可见SARS-CoV-2与细菌和真菌混合感染率与疾病严重程度成正比[8]。在COVID-19的治疗中，抗生素的使用率很高，而抗生素使用不当导致的耐药性加剧了COVID-19治疗的复杂性[46]。微生物共感染可能对COVID-19的治疗和预后有极大影响。现有研究显示，SARS-CoV-2通过肠道引起肠道微生态变化，进而通过肠-肺轴引起肺部炎症。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》[47]提到，可使用肠道微生态调节剂维持肠道微生态平衡，以预防继发的细菌感染。肠-肺轴通过调节呼吸道微生态减轻病毒感染导致的损伤与病变，这与中医理论“肺与大肠相表里”相契合。使用微生态制剂(如益生菌)调节肠道微生态有益于促进呼吸道微生态的稳定，并减少抗生素的使用，降低机体对抗生素的耐药性，进而提高肺部炎症的治疗效果[13]。

3.4变应性鼻炎 变应性鼻炎是一种免疫球蛋白E介导的鼻黏膜炎症，由变应原进入致敏个体引起。在变应性鼻炎的风险中，基因遗传因素起重要作用[48]。然而，Schwager等[49]发现，澳大利亚长期移民中国人的革兰阳性菌感染率高于短期移民中国人，且金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的感染率显著升高，表明环境因素等对变应性鼻炎的发展有重要影响。健康婴儿出生后的鼻腔细菌多样性随着时间的推移而增加，而鼻炎婴儿的细菌多样性下降；在出生18个月鼻炎伴哮鸣音婴儿鼻腔中，草酸杆菌科更为丰富，而健康婴儿鼻腔中以棒状杆菌科和葡萄球菌科的早期定植更多[9]。在3～5岁螨过敏性鼻炎婴儿咽部，嗜血杆菌属、奈瑟菌属和莫拉菌属等的数量多于健康婴儿，特别是莫拉菌属，现已证实其参与了螨类致敏与鼻炎的相互作用，提示莫拉菌属种不仅可能有助于控制鼻炎，还可能在调节变应性鼻炎相关变应原致敏方面发挥作用[50]。早期鼻微生物群以棒状杆菌为主的婴儿的上呼吸道感染发病率较低[51]，健康婴儿鼻上皮中的棒状杆菌可抑制金黄色葡萄球菌定植，从而减少金黄色葡萄球菌感染的发生[52]。据报道，下鼻甲鼻黏膜微生物群的失调，特别是金黄色葡萄球菌的增加和痤疮丙酸杆菌的减少，与变应性鼻炎患者免疫球蛋白E水平的升高有关[53]。此外，鼻病毒可促进免疫球蛋白E生成，鼻病毒感染可诱导与B细胞活化相关的辅助性T细胞2的表达，如IL-4和IL-13以及IL-33和IL-25是鼻病毒感染和辅助性T细胞2介导的炎症反应之间的重要联系[54-55]。此外，Morin等[56]的一项前瞻性研究显示，上呼吸道微生物群与DNA甲基化遗传效应图谱之间存在纵向联系，表明生命早期上呼吸道中的细菌定植在形成鼻上皮的表观遗传学特征方面起着重要作用，且该作用至少持续至儿童后期，并影响变应性鼻炎的发展。微生态失调可能通过破坏紧密连接导致上皮通透性增加，进而使上皮屏障功能障碍，而共生生物可能通过防止病原体定植以及提供改善黏膜健康的代谢物发挥保护作用。因此，益生菌可能作为恢复生态失调的潜在策略。一些益生菌菌株(如大肠埃希菌Nissle 1917)可通过紧密连接相关基因或黏附连接相关基因的表达增加上皮屏障的完整性[57]。此外，益生菌还可与病原体竞争黏附，竞争性排斥病原微生物，产生抗微生物物质，调节免疫系统[58]。Miraglia Del Giudice等[59]研究显示，双歧杆菌混合物可显著改善花粉诱发的变应性鼻炎患者的症状和生活质量。

3.5哮喘 哮喘由多种细胞及细胞组分参与，以支气管高反应性和气道慢性炎症为特征。稳定型哮喘的呼吸道微生物群种类和丰度有一定特征，嗜血杆菌等致病变形菌在成人和儿童哮喘患者的支气管中均常见，但哮喘患者体内缺乏拟杆菌门等[1]。Abdel-Aziz等[60]研究发现，基于微生物组分布的无偏聚类可将严重哮喘患者分为两个表型聚类，这两个表型聚类的微生物群(包括埃氏弧菌属、普雷沃菌属等菌属)有明显差异特征，认为痰微生物群可作为更好区分哮喘表型的生物标志物。研究表明，当不同疾病患者呼吸道微生态相似时，如微生物门水平上相似、临床相关菌属的相对丰度相似，聚类分析可以区分疾病的共同和特有的亚组[11]。

哮喘具有性别差异，其与主要宿主因素(如免疫反应、气道解剖学)的关联可能受到性别的影响，且得到了近年多项实验研究的证实。Chen等[61]发现，男性和女性哮喘患者痰液样本中唾液链球菌的相对丰度有显著差异，与唾液链球菌丰度相对较高个体相比，唾液链球菌丰度相对较低个体的哮喘患病风险可能更高，且嗜血杆菌属与哮喘的相关性仅与男性有关。气道微生物群可能是哮喘性别差异的重要潜在机制，故考虑特定性别背景的气道微生物学研究未来可能有助于提高疾病的分辨率。总之，在一定条件下，某些微生物成分与哮喘有一定的相关性，根据特征微生物进行的哮喘分型，有利于患者的个性化治疗。但上述研究缺乏具体机制的研究，且尚未排除环境、实验前抗生素使用等因素的干预，故仍需进一步研究。

4 小 结

呼吸道微生态与呼吸系统疾病的关联性极强。随着微生态研究技术的不断进步，正常呼吸道各部微生态组分现已基本明确，故可通过调控微生态来治疗疾病，以特征性微生物为指标判断疾病，并通过调控微生态获得特定的呼吸系统疾病模型。目前研究多局限于对试验效果的评估，且已有研究为未来益生菌的科学使用提供了积极证据[13,59]。此外，合成生物学疗法是一种新兴且具有前景的疾病治疗方法，共生菌或益生菌作为载体可在呼吸道微生态中稳定定植，并靶向对抗病原菌感染，以减少抗生素类抗感染药物的非特异性杀伤[62]。在调控微生态时，还需找到更安全、有效、规范的抗生素和微生态制剂的使用方案。由于微生态与机体自身的复杂性以及个体差异性，未来还需要探究微生物在疾病发生发展中的具体作用机制，以实现呼吸系统疾病的个性化治疗，并为研究技术的改良与创新提供支持。