聚乙二醇修饰的重组人睫状神经营养因子对非酒精性脂肪肝的药效学作用

李素贞，闫甲丽，刘建伟，祁芳冰，刘明杨，郭蓓蕾，晁华，王健

国药中生生物技术研究院有限公司第四研究室，北京 101111

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确的损肝因素外所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征［1-2］。NAFLD患者疾病终末期会因严重肝病、脑血管疾病导致死亡［3］。NAFLD也是日益增长的肝硬化和肝癌的发生原因之一［4］，随着社会的发展和人们生活水平的不断提高，NAFLD逐渐成为威胁人类健康及增加经济负担最常见的慢性肝病之一［5］，发病率不断升高，且患病人群日趋年轻化［6-7］。但目前仍缺乏有效的治疗NAFLD的药物［3，8-9］。

睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）是一个具有多种生物活性的神经生长因子［10-13］，自从发现其具有减轻体重的作用后［14］，多个研究探索了其作为潜在的治疗肥胖［15］、改善糖脂代谢药物的成药性［16-18］，及其促进糖、脂代谢和调节能量平衡以及摄食行为［19］。这些作用均提示了CNTF对NAFLD具有一定的治疗作用，有必要进行深入研究。但CNTF在体内血液中的保留半衰期很短，仅2.9 min［20］，聚乙二醇修饰（PEGylation）能通过减少肾清除率、降低酶解速率及免疫原性等改善药物的理化性质，从而有效延长药物在体内的停留时间、增强体内药效［21-22］。

本研究组用PEG定点修饰重组突变体rhCNTF的63位精氨酸残基，获得了具有更长半衰期的产物PEGrhCNTF［23］。本研究进一步通过ob／ob小鼠动物模型探讨rhCNTF及PEG-rhCNTF对NAFLD的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料SPF级野生型C57BL／6J小鼠（14只，雌性，4～10周龄，以标准饲料喂养，体质量平均18.9 g）和SPF级ob／ob小鼠（83只，雌性，4～10周龄，以高脂饲料喂养，体质量平均49.4 g）均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，本实验均以科研为目的对小鼠进行养殖和使用，且按照《北京市实验动物福利伦理审查指南》相关规定进行（35892-2018）；标准饲料购自北京科奥协力饲料有限公司；高脂饲料购自上海普路腾生物科技有限公司。

1.2 rhCNTF和PEG-rhCNTF注射用rhCNTF和PEG-rhCNTF由本实验室制备［11］。

1.3 主要试剂 利拉鲁肽购自诺和诺德（中国）制药有限公司；小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒Mouse Insulin（INS）ELISA Kit购自武汉华美生物工程有限公司。

1.4 动物分组及给药C57BL／6J小鼠作为对照组，ob／ob小鼠随机分为7组，每组11～12只：rhCNTF 0.1 mg／kg组，每天皮下注射给药1次，0.1 mL／10 g，共给药16 d；PEG-rhCNTF 3个剂量组（0.05、0.1、0.2 mg／kg）和赋形剂（成分3%甘氨酸，3%海藻糖，8%甘露醇）组，每4 d皮下注射给药1次，0.1 mL／10 g，共给药4次；利拉鲁肽0.1 mg／kg组，每天皮下注射给药2次，共给药16 d；利拉鲁肽0.2 mg／kg组，每4 d皮下注射给药1次，与PEG-rhCNTF给药同步。在测定连续血糖的当天（PEG-rhCNTF第1、3针），rhCNTF和PEG-rhCNTF均移至上午给药，其他均在下午4：00给药。动物处死前一夜禁食不禁水，次日上午于处死前2 h给药1次。

1.5 动物体质量及饲料消耗量测定 给药前连续测定3 d的24 h饲料消耗量，取平均值，给药后每天定时测定24 h饲料消耗量及体质量，按下式计算体质量和摄食量变化率。

1.6 口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）及血糖曲线下面积（area under the curve，AUC）检测 小鼠禁食不禁水12～14 h，先测空腹（0 h）血糖（fasting plasma glucose，FPG），再于灌胃20%葡萄糖溶液（高压灭菌）后0.5、1、2 h分别测定血糖浓度，建立血糖-时间曲线，并计算AUC。

1.7 胰岛素抵抗测定 试验终点时，所有动物禁食12～14 h后给药，并在给药后约2 h测定FPG水平。乙醚麻醉后经眼眶动静脉采血，室温放置30 min后1 000×g离心10 min分离血清，-80℃低温冰箱保存，测定空腹血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS）水平，并计算胰岛素抵抗指数，用稳态模型（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMAIR）来评估，按下式计算。HOMA-IR反映了机体对胰岛素的敏感度，其值越小，表明机体对胰岛素越敏感。

1.8 肝脏湿重及脂肪变性程度检测 肝脏称重后取肝中叶一块于福尔马林中固定，另取一份用预冷的生理盐水冲洗、滤纸吸干水分后，置于液氮中保存。将小鼠肝中叶以4%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片后HE染色，光镜下观察，若肝细胞内出现1个或多个完整透明的圆形空泡且肝细胞核受压迫偏移至一侧，判为肝细胞脂肪变性。脂肪变性程度判定标准为0级：肝细胞形态正常，几乎未出现脂肪变性；Ⅰ级：脂肪变性的肝细胞数＜30%，为轻度肝脏脂肪变性；Ⅱ级：30%～60%的肝细胞发生脂肪变性，为中度肝脏脂肪变性；Ⅲ级：＞60%的肝细胞发生脂肪变性，为重度肝脏脂肪变性。

1.9 体脂重量测定 取肠系膜脂肪、后腹膜脂肪和皮下脂肪分别称重，三者之和为体脂总重量，肠系膜和后腹膜脂肪之和为内脏脂肪重量，并取后腹膜（生殖器周围）脂肪于福尔马林中固定。

1.10 统计学分析 采用SPSS 20统计学软件进行统计学分析，实验结果以平均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PEG-rhCNTF对ob／ob小鼠摄食和体质量的影响 各组小鼠摄食量变化率见表1，体质量变化率见表2。PEG-rhCNTF对ob／ob小鼠的食欲有显著影响，0.05 mg／kg剂量组摄食量变化率给药后1～10 d与给药前相比，除3 d外，差异均有统计学意义（F=11.120，P分别为0.000、0.006、0.000、0.001、0.000、0.004、0.000、0.000、0.011）；0.1 mg／kg剂量组摄食量变化率给药后1～10 d与给药前相比，除3和4 d外，差异均有统计学意义（F=16.469，P均为0.000）；0.2 mg／kg剂量组摄食量变化率给药后1～10 d与给药前相比，差异均有统计学意义（F=17.253，P分别为0.000、0.000、0.003、0.015、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.001）。且伴随着食欲的抑制，体质量也显著降低，0.05 mg／kg剂量组体质量变化率给药后1～16 d与给药前相比，除1、3、4 d外，差异均有统计学意义（F=10.502，2、5 d的P分别为0.016和0.044，之后时间的P均为0.000）；0.1 mg／kg剂量组体质量变化率给药后1～16 d与给药前相比，除1、4、5 d外，差异均有统计学意义（F=6.206，2、3 d的P分 别 为0.021和0.022，之 后 时 间 的P均 为0.000）；0.2 mg／kg剂量组体质量变化率给药后1～16 d与给药前相比，差异均有统计学意义（F=31.024，1 d的P为0.010，之后时间的P均为0.000）；这种变化具有明显的剂量依赖性。至最后1个给药周期，其对食欲的抑制作用有所减弱，同时也伴随着体质量的回升。表明PEG-rhCNTF的减肥作用，尤其是在治疗初期，与抑制食欲密切相关。利拉鲁肽0.2 mg／kg组摄食量变化率仅给药当天（即4、8、12 d）与给药前相比，差异有统计学意义（F=20.878，P分别为0.000、0.000和0.028），体质量变化率仅给药次日和最后两天（即1、5、9、15、16 d）与给药前相比，差异有统计学意义（F=8.563，P分别为0.000、0.001、0.000、0.028和0.002），效果不如PEG-rhCNTF，表明PEG-rhCNTF的减质量和食欲抑制效果更稳定，更持久。rhCNTF 0.1 mg／kg组能在给药初期（给药后1～10 d）减少ob／ob小鼠的摄食量，与给药前相比，除3 d外，差异均有统计学意义（F=5.007，P分别为0.001、0.023、0.028、0.000、0.000、0.000、0.000、0.001和0.035），但至实验结束，小鼠体质量变化率与给药前相比，差异均无统计学意义（F=0.502，P均＞0.05），表明与rhCNTF相比，PEG-rhCNTF减质量和食欲抑制效果更明显、更稳定可靠，且克服了其短效、需每天给药的缺点。

2.2 PEG-rhCNTF对ob／ob小鼠口服葡萄糖耐量的影响 给药前ob／ob小鼠糖耐量显著异常，与对照组相比，ob／ob小鼠FPG及各检测时间点血糖均明显升高，且差异均有统计学意义（0 h的F=4.230，P分别为0.001、0.001、0.000、0.000、0.000、0.003、0.000；0.5 h的F=9.929，P均为0.000；1 h的F=3.189，P分别为0.002、0.001、0.001、0.000、0.012、0.003、0.001；2 h的F=6.375，P均为0.000），见表3。给药16 d后，rhCNTF对ob／ob小鼠的糖耐量异常无明显改善作用，rhCNTF 0.1 mg／kg组FPG及各检测时间点血糖与对照组相比，均明显升高（0 h的F=4.458，P=0.045；0.5 h的F=25.874，P=0.000；1 h的F=11.862，P=0.000；2 h的F=7.800，P=0.000），与赋形剂组相比，则基本无变化（0 h的F=4.458，P=1.000；0.5 h的F=25.874，P=1.000；1 h的F=11.862，P=1.000；2 h的F=7.800，P=0.542）；PEG-rhCNTF可改善糖耐量异常，且呈剂量依赖性，其中PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg组FPG及各检测时间点血糖与对照组相比，基本无变化（F分别为4.458、25.874、11.862、7.800，P均 为1.000）。见表4。

表1 各组ob／ob小鼠的摄食量变化率（%，±s）Tab.1 Change rates of food intake of ob／ob mice in various groups（%，±s）

表1 各组ob／ob小鼠的摄食量变化率（%，±s）Tab.1 Change rates of food intake of ob／ob mice in various groups（%，±s）

注：与0 d相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

组别对照赋形剂利拉鲁肽0.1 mg／kg利拉鲁肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg n 11 11 11 11 11 12 11 11给药后时间（d）00 0 0 0 0 0 0 0 1 0.01±0.19-0.15±0.04-0.49±0.16aa-0.07±0.08-0.26±0.07aa-0.41±0.10aa-0.59±0.12aa-0.87±0.02aa 2-0.21±0.18-0.18±0.14-0.45±0.12aa-0.48±0.12-0.20±0.11a-0.26±0.12aa-0.44±0.17aa-0.86±0.09aa 3-0.21±0.13-0.04±0.03-0.48±0.06aa 0.08±0.23-0.17±0.11-0.04±0.08-0.08±0.11-0.48±0.14aa 4-0.15±0.12-0.07±0.09-0.44±0.03aa-0.57±0.07aa-0.20±0.02a-0.32±0.10aa-0.24±0.15-0.43±0.07a 5-0.21±0.21-0.20±0.05-0.32±0.14-0.21±0.13-0.30±0.04aa-0.67±0.04aa-0.81±0.06aa-0.94±0.03aa 6-0.18±0.17-0.16±0.06-0.37±0.12 0.05±0.11-0.30±0.04aa-0.49±0.09aa-0.66±0.16aa-0.82±0.27aa 7-0.05±0.22-0.23±0.23-0.28±0.25 0.04±0.12-0.27±0.05aa-0.26±0.05aa-0.43±0.15aa-0.87±0.10aa组别对照赋形剂利拉鲁肽0.1 mg／kg利拉鲁肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg n 11 11 11 11 11 12 11 11给药后时间（d）8-0.19±0.19-0.24±0.07-0.35±0.14-0.73±0.05aa-0.35±0.06aa-0.37±0.05aa-0.56±0.07aa-0.78±0.14aa 9-0.10±0.11-0.18±0.12-0.29±0.14 0.01±0.10-0.25±0.10aa-0.41±0.06aa-0.62±0.06aa-0.78±0.11aa 10-0.07±0.20-0.03±0.03-0.20±0.16 0.18±0.18-0.20±0.05a-0.25±0.07a-0.43±0.09aa-0.52±0.22aa 11-0.20±0.13-0.12±0.07-0.22±0.19 0.22±0.16-0.17±0.03-0.12±0.09-0.24±0.09-0.38±0.23 12 0.09±0.21-0.11±0.12-0.16±0.13-0.35±0.05a-0.18±0.06-0.20±0.10-0.16±0.04-0.33±0.16 13-0.24±0.13-0.08±0.04-0.23±0.20 0.01±0.15-0.17±0.04-0.32±0.05aa-0.26±0.16-0.27±0.17 14-0.09±0.19-0.12±0.11-0.28±0.10 0.24±0.14-0.27±0.14aa-0.17±0.11-0.21±0.17-0.19±0.16 15-0.04±0.22-0.12±0.07-0.31±0.13 0.22±0.10-0.21±0.07a-0.16±0.10-0.15±0.05-0.18±0.11

表2 各组ob／ob小鼠的体质量变化率（%，±s）Tab.2 Change rates of body weight of ob／ob mice in various groups（%，±s）

表2 各组ob／ob小鼠的体质量变化率（%，±s）Tab.2 Change rates of body weight of ob／ob mice in various groups（%，±s）

注：与0 d相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

组别对照赋形剂利拉鲁肽0.1mg／kg利拉鲁肽0.2mg／kg rhCNTF 0.1mg／kg PEG-rhCNTF 0.05mg／kg PEG-rhCNTF 0.1mg／kg PEG-rhCNTF 0.2mg／kg n 11 11 11 11 11 12 11 11给药后时间（d）9-1.73±3.04 3.34±3.85-4.26±5.24-3.98±1.36aa 0.01±2.54-5.16±2.38aa-11.01±4.90aa-21.50±2.52aa 10-2.97±4.10a 2.12±4.40-5.36±5.34a-1.38±2.35-1.72±2.66-6.94±2.38aa-12.57±4.64aa-23.60±2.89aa 11 0.34±2.63 4.20±4.89a-4.28±6.92 0.94±3.04-0.56±2.51-6.11±2.58aa-11.82±5.31aa-22.68±4.37aa 12 0.62±2.99 4.38±5.33a-4.44±7.39 1.04±2.99-0.16±2.83-5.15±2.86aa-11.05±6.15aa-20.77±7.36aa 13 1.62±3.66 5.05±6.08aa-3.98±7.88-1.71±2.80-0.50±3.55-5.52±3.45aa-10.54±5.9aa-21.10±5.57aa 14 2.04±3.77 5.41±5.94aa-4.12±8.00 1.87±3.66 0.33±4.03-6.62±3.4aa-10.50±6.90aa-20.40±6.64aa 15 0.95±3.54 6.07±5.71aa-4.18±8.36 2.33±4.05a 0.07±5.09-4.97±3.64aa-9.99±7.48aa-19.06±6.93aa 16 1.57±3.92 6.35±6.54aa-4.28±8.99 3.30±4.48aa 0.52±4.96-4.47±3.56aa-8.94±7.84aa-18.21±6.95aa组别对照赋形剂利拉鲁肽0.1 mg／kg利拉鲁肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg n 11 11 11 11 11 12 11 11给药后时间（d）0000 0 0 0 0 0 1-1.26±2.51 1.09±1.30-3.99±1.39-4.23±1.14aa-0.33±0.90-0.94±0.74-2.44±1.49-4.69±1.47aa 2-2.12±2.50 0.95±1.08-3.95±2.16-1.27±1.24-0.59±0.81-2.37±1.20a-5.05±2.35a-8.55±1.20aa 3-1.92±3.61 1.24±1.73-4.19±3.03-0.94±1.30-0.51±1.09-1.35±1.42-4.88±3.24a-10.92±1.70aa 4-1.72±1.39 2.68±2.33-3.77±3.16 0.89±1.49 0.67±1.50-0.20±1.55-3.94±4.20-10.48±2.05aa 5-1.94±2.57 3.10±3.03-3.88±3.33-3.49±1.24aa 0.70±1.71-1.98±1.88a-3.50±4.44-10.75±1.97aa 6-2.69±3.47a 2.45±2.82-4.14±3.31-0.55±1.53 0.20±1.80-4.80±2.04aa-8.65±3.85aa-15.4±1.62aa 7-2.81±3.5a 2.91±3.48-3.85±4.11 0.00±1.88-0.41±2.07-5.12±1.57aa-9.41±4.55aa-18.91±1.73aa 8-2.72±3.27a 3.42±4.08-5.05±3.96a 1.25±2.41-0.06±2.30-3.99±2.24aa-8.47±3.88aa-20.61±2.00aa

表3 给药前各组小鼠的口服葡萄糖耐量（mol／L，±s）Tab.3 Oral glucose tolerances of mice in various groups before treatment（mol／L，±s）

表3 给药前各组小鼠的口服葡萄糖耐量（mol／L，±s）Tab.3 Oral glucose tolerances of mice in various groups before treatment（mol／L，±s）

注：与对照组相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

组别对照赋形剂利拉鲁肽0.1 mg／kg利拉鲁肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg 2 h 4.41±1.27 7.43±1.50aa 7.91±1.48aa 9.02±2.92aa 7.77±1.60aa 8.15±1.68aa 8.17±2.46aa 7.64±1.93aa n 13 12 12 12 11 12 12 12 0 h 3.85±0.71 7.04±1.96aa 6.98±1.88aa 7.34±3.34aa 7.95±1.90aa 7.83±2.65aa 6.63±2.25aa 7.39±2.46aa 0.5 h 13.65±4.11 25.34±4.92aa 24.12±5.10aa 23.86±5.39aa 26.13±3.59aa 25.76±5.00aa 24.23±4.08aa 24.83±4.24aa 1 h 7.68±1.65 13.26±3.69aa 13.73±4.52aa 13.67±4.25aa 14.67±6.51aa 12.10±2.76a 12.94±4.82aa 13.63±4.83aa

表4 给药后各组小鼠的口服葡萄糖耐量（mol／L，±s）Tab.4 Oral glucose tolerances of mice in various groups after treatment（mol／L，±s）

表4 给药后各组小鼠的口服葡萄糖耐量（mol／L，±s）Tab.4 Oral glucose tolerances of mice in various groups after treatment（mol／L，±s）

注：与对照组相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

组别对照赋形剂利拉鲁肽0.1 mg／kg利拉鲁肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg n 10 10 12 10 11 12 11 11给药后时间（d）0 h 5.30±0.91 6.46±1.39 6.06±3.19 3.95±0.77 8.11±3.09a 6.00±1.37 4.79±1.34 4.90±1.69 0.5 h 10.68±2.04 27.01±2.38aa 22.54±6.01aa 15.65±3.36aa 26.72±5.52aa 23.21±1.83aa 20.99±4.94aa 11.52±3.96 1 h 6.97±1.12 16.38±5.12aa 10.43±4.77 5.63±1.42 17.59±6.44aa 11.41±4.44 11.10±5.26 5.79±1.61 2 h 5.01±0.85 7.21±2.89 4.18±1.13 4.07±0.94 9.46±3.87aa 6.78±2.35 5.95±1.79 4.85±1.51

2.3 PEG-rhCNTF对ob／ob小鼠FPG、FINS及胰岛素敏感性的影响 利拉鲁肽、rhCNTF和PEG-rhCNTF均具有减轻胰岛素抵抗的作用（利拉鲁肽0.1 mg／kg组：t=3.619，P=0.002；利拉鲁肽0.2 mg／kg组：t=4.339，P=0.001；rhCNTF 0.1 mg／kg组：t=2.342，P=0.032；PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg组：t=2.947，P=0.008；PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg组：t=4.379，P=0.001；PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg组：t=6.457，P=0.000），但PEG-rhCNTF还具有控制血糖（0.1 mg／kg组：t=5.235，P=0.000；0.2 mg／kg组：t=6.666，P=0.000）和减轻高胰岛素血症（0.05 mg／kg组：t=2.942，P=0.008；0.1 mg／kg组：t=2.390，P=0.029；0.2 mg／kg组：t=4.041，P=0.001）的作用，利拉鲁肽则未体现出减轻高胰岛素血症的作用（0.1 mg／kg组：t=0.211，P=0.835；0.2 mg／kg组：t=-0.317，P=0.754），rhCNTF不能有效控制血糖（t=-0.320，P=0.753），且其为短效制剂，需每天给药。见图1。因此，在减轻胰岛素抵抗作用中，PEG-rhCNTF的效果优于利拉鲁肽和rhCNTF。

图1 各组ob／ob小鼠FPG（A）、FINS（B）和HOMA-IR（C）Fig.1 FPG（A），FINS（B）and HOMA-IR（C）of ob／ob mice in various groups

续图1各组ob／ob小鼠FPG（A）、FINS（B）和HOMAIR（C）Fig.1（Continued）FPG（A），FINS（B）and HOMA-IR（C）of ob／ob mice in various groups

2.4 PEG-rhCNTF对ob／ob小鼠肝脏和脂肪重量的影响PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg和利拉鲁肽0.1 mg／kg组ob／ob小鼠与赋形剂组比较，肝脏重量显著降低（t分别为3.770和3.887，P分别为0.001和0.01），其余各给药组与赋形剂组小鼠比较，肝脏重量差异无统计学意义（利拉鲁肽0.2 mg／kg组：t=1.347，P=0.193；rhCNTF 0.1 mg／kg组：t=0.717，P=0.481；PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg组：t=1.573，P=0.131；PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg组：t=1.240，P=0.229），表明PEG-rhCNTF有减轻ob／ob小鼠肝湿重的作用。试验终点时，与赋形剂组肠系膜、后腹膜和皮下脂肪重量比较，PEG-rhCNTF的减脂作用主要体现在减轻皮下脂肪的重量（t=4.958，P=0.000），表明其减肥作用与减轻皮下脂肪含量密切相关。而利拉鲁肽和rhCNTF的减脂作用并不明显（体脂总重，利拉鲁肽0.1 mg／kg组：t=1.919，P=0.069；利拉鲁肽0.2 mg／kg组：t=0.215，P=0.832；rhCNTF 0.1 mg／kg组：t=0.985，P=0.336）。见图2。

2.5 PEG-rhCNTF对ob／ob小鼠肝脏脂肪病变程度的影响 肝脏组织HE切片观察显示，对照组C57小鼠肝小叶结构正常，肝索明显，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，动脉壁粉色浅染，肝细胞呈多边形，胞浆丰富且浅染，细胞核圆形深染且居中，偶见处于分裂期的双核细胞，可见核仁，汇管区清晰可辨，无纤维组织增生及炎细胞浸润病变。与C57小鼠相比，赋形剂组ob／ob小鼠肝脏组织出现重度脂肪性变，光镜下80%以上肝细胞的胞浆中出现多数大的脂肪空泡，脂变的肝细胞以中央静脉向外弥散，越远离中央静脉，脂肪空泡越大。肝细胞较正常细胞体积明显增大，胞浆内充满大小不一的球形脂肪空泡，有的大的脂肪空泡可充满整个胞浆将胞核挤至一侧，细胞核发生固缩，甚至有些细胞难以观察到细胞核，体积变大，变圆，形似脂肪细胞，肝小叶结构不明显。由于制做切片时脂滴被脂溶性溶剂溶解，只剩下圆形空泡。除了发生脂肪性变外，赋形剂组ob／ob小鼠肝细胞还出现了汇管区纤维组织增生，并伴有炎细胞浸润，小叶间胆管增生，动脉壁增厚且红染，并伴有细胞核竖立，部分肝细胞出现嗜酸样变以及少量小灶状炎细胞浸润，小叶间出现纤维化。与赋形剂组相比，利拉鲁肽、rhCNTF和PEG-rhCNTF各剂量组ob／ob小鼠肝细胞的以下病变均有所减轻：汇管区纤维组织增生并伴有炎细胞浸润，小叶间胆管增生，小灶状炎细胞浸润，嗜酸样变，核固缩以及纤维化；而对动脉壁增厚且红染，细胞核竖立的症状并无减轻作用。见图3。

图2 各组ob／ob小鼠的肝脏和脂肪重量Fig.2 Liver and fat weights of ob／ob mice in various groups

图3 各组ob／ob小鼠的肝脏脂肪病变程度观察（HE染色，×400）Fig.3 Microscopy of hepatic steatosis of ob／ob mice in various groups（HE staining，×400）

对ob／ob小鼠肝脂肪变性程度的半定量统计结果表明，利拉鲁肽、rhCNTF和PEG-rhCNTF均可减轻肝脂肪变性，与赋形剂组比较，差异均有统计学意义（利拉鲁肽0.1 mg／kg组：t=3.619，P=0.002；利拉鲁肽0.2 mg／kg组：t=4.339，P=0.001；rhCNTF 0.1 mg／kg组：t=2.342，P=0.032；PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg组：t=2.947，P=0.008；PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg组：t=4.379，P=0.001；PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg组：t=6.457，P=0.000），但PEG-rhCNTF的效果优于利拉鲁肽和rhCNTF。见图4。

图4 各组ob／ob小鼠肝脏脂肪变性程度Fig.4 Degrees of hepatic steatosis of ob／ob mice in various groups

3 讨 论

本研究通过测定小鼠治疗期间体质量和24 h饲料消耗量的变化，以及实验终点时肠系膜脂肪、后腹膜脂肪和皮下脂肪重量，来探讨PEG-rhCNTF的减肥作用特点。结果表明，PEG-rhCNTF减质量和食欲抑制效果明显、稳定可靠，且克服了短效、需每天给药的缺点，其减脂作用主要体现在减轻皮下脂肪的重量。

OGTT是目前公认的诊断糖尿病的金标准［24］。通过治疗期间对随机血糖和连续血糖的监测，可得出PEG-rhCNTF具有稳定可靠的降糖作用，且具有量效关系，剂量越大，降糖效果越稳定。利拉鲁肽和rhCNTF的降糖作用在治疗后期均有一定程度的减弱，效果不够稳定，且随着给药周期的延长，血糖均出现回升，可能与其免疫原性较强有关。胰岛素抵抗是诱发糖尿病的主要因素之一。本研究对实验终点FPG和FINS水平进行测定，并计算HOMA-IR。HOMAIR反映了机体对胰岛素的敏感度，其值越小，表明机体对胰岛素越敏感。实验结果表明，PEG-rhCNTF、利拉鲁肽和rhCNTF均具有减轻胰岛素抵抗的作用，但PEG-rhCNTF还具有控制血糖和减轻高胰岛素血症的作用，而利拉鲁肽未体现出减轻高胰岛素血症的作用，rhCNTF不能有效控制血糖，且其为短效制剂，需每天给药。因此，在减轻胰岛素抵抗作用中，PEGrhCNTF优于利拉鲁肽和rhCNTF。

肝脏是机体糖代谢和能量代谢的主要器官，当机体脂代谢紊乱时，肝脏将过多的甘油三酯转化为游离脂肪酸并释放入血，这些游离脂肪酸沉积在机体的外围组织，引起组织的脂变，并且造成外围组织胰岛素抵抗的发生［25-26］。对ob／ob小鼠肝脂肪变性程度的半定量统计结果表明，PEG-rhCNTF、利拉鲁肽和rhCNTF均可减轻肝脂肪变性，但PEG-rhCNTF的效果优于利拉鲁肽和rhCNTF，该组小鼠肝脏脂变程度已接近正常小鼠水平。

综上所述，PEG-rhCNTF有减轻ob／ob小鼠肝脂肪变性的作用，其短期作用的主要机理是抑制食欲、减少能量摄入，同时还能降低血糖和血胰岛素水平，改善糖耐量异常，增强胰岛素敏感性。但PEG-rhCNTF目前尚处于临床前药理学研究阶段，尚不能确定该药物能否作为脂肪肝治疗的一种有效手段，对其能否应用于临床还需进一步研究。本研究对PEG-rhCNTF的药效学和免疫原性研究尚处于起步阶段，特别是针对其具体作用机理，仍需进一步开展研究。