蜱传脑炎病毒非结构蛋白1的原核表达、纯化及应用

张婷婷，王伟，陈子杨，李景良，张颖，孙宏亮，常军亮

1.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130012；2.黑龙江红十字（森工总）医院急诊科，黑龙江 哈尔滨 150040

蜱传脑炎（tick-borne encephalitis，TBE）又称森林脑炎，是由森林脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的以中枢神经系统病变为主要特征的急性传染病［1-3］。TBEV属于黄病毒科黄病毒属，主要通过蜱虫传播。临床重症TBE患者以高热、头痛、昏迷、颈项强直、脑膜刺激症为主要特征，病死率及致残率极高。东北地区为我国TBE主要自然疫源地［4-7］。目前临床尚无针对TBEV特效抗病毒治疗药物，主要采用对症治疗的辅助手段，缓解症状，治疗效果差，疫苗接种是预防该疾病最有效的方法［7-8］。黄病毒属病毒间存在较强的抗原交叉反应性，使疾病的诊断及鉴别诊断、病原及血清流行病学调查、疫苗研究和检测试剂的开发存在一定的困难［9-10］。

TBEV基因组为单股正链RNA，全长约11 000 bp，为单一开放读码框，编码3种结构蛋白（C、M、E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、ND4a、NS4b、NS5）。非结构蛋白NS1为相对分子质量46 000～55 000的高度保守的糖蛋白，具有糖基化位点、二硫键，不包含任何跨膜区及翻译后脂质修饰。在细胞中，NS1以二聚体形式存在，协助病毒基因组复制以及感染宿主，同时部分NS1以分泌形式存在于细胞外，可诱导机体产生相应的保护性抗体，参与细胞免疫［11］。有研究表明，NS1抗体不直接参与病毒中和，但在黄病毒种间具有特异性，这为基于NS1建立特异性黄病毒感染的血清学诊断提供了新的选择，NS1蛋白是黄病毒的主要抗原标志，感染宿主血液中NS1抗体含量很高，在初次接触4～8 d内的感染者血液中即可被检测到，因此，NS1是黄病毒感染早期诊断的标志［12-14］。

目前商品化的登革热NS1抗原检测试剂盒采用原核表达的重组NS1蛋白作为ELISA包被抗原，用于诊断登革热病毒早期感染［15-16］。基于上述黄病毒研究数据，本研究原核表达、纯化TBEV“森张”株重组NS1蛋白，鉴定其与TBEV全病毒多克隆抗体的特异性反应，并采用以重组NS1蛋白为包被抗原的间接ELISA法检测临床血清，初步评价其在TBEV抗体检测的临床应用价值，为TBE疾病诊断、血清流行病学调查、病毒蛋白结构和功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体、菌株、毒株、蛋白及血清pGEX-4T-1质粒、TBEV“森张”株、TBEV全病毒感染小鼠不同天数血清及TBEV重组E蛋白均为长春生物制品研究所有限责任公司生物技术室保存；大肠埃希菌Trans1-T1 Phage Resistant和BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；临床血清样本由黑龙江红十字（森工总）医院提供。

1.2 主要试剂及仪器 限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶、fastpfuDNA聚合酶和质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；片段回收试剂盒和凝胶回收试剂盒购自日本TaKaRa公司；羊抗鼠IgM-HRP购自武汉Elabscience公司、小鼠抗人IgG-HRP购自武汉科源安博生物技术有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP购自北京中杉金桥生物技术有限公司；GST琼脂糖凝胶填料购自美国GE公司；增强型DAB显色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；凝胶成像分析仪和全自动酶标仪购自美国Bio-rad公司；高压均质机购自加拿大ATS公司；SCG纯化系统购自苏州赛普仪器公司。

1.3 引物设计及合成 根据GenBank上登录的TBEV“森张”株NS1基因序列（JQ650523.1），应用Premier 5.0软件设计TBEVC基因扩增引物，上游引物序列：5'-ATGGATCCATGGATGTTGGCTGTGCTGTGGA-3'（下划线部分为BamHⅠ酶切位点），下游引物序列：5'-ATCTCGAGTTATGCCACTACCATTGAGCGA-3'（下划线部分为XhoⅠ酶切位点）。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 目的基因的扩增 采用TRIZOL法从TBEV中提取病毒总RNA，反转录为cDNA，以其为模板进行PCR扩增。反应体系共50µL：cDNA模板1µL，上、下游引物各1µL（10µmol／L），5×fastpfubuffer 10µL，dNTP（2.5 mmol／L）4µL，fastpfuDNA聚合酶1µL，补ddH2O 32µL。反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 重组表达质粒的构建PCR产物与载体pGEX-4T-1分别经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，胶回收试剂盒回收目的基因片段及载体片段，以T4 DNA连接酶于16℃连接过夜；连接产物转化至大肠埃希菌Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞，经氨苄青霉素抗性（50µg／mL）选择培养，挑取形态良好的单克隆菌落，进行菌落PCR鉴定，并提取质粒，进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，鉴定正确的阳性质粒送吉林省库美生物科技有限公司测序，测序正确的重组表达质粒命名为pGEX-4T-1-NS1。

1.6 目的基因的诱导表达 将重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1转化大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性（50µg／mL）的固体琼脂平板上培养过夜，筛选阳性克隆菌，接种于氨苄青霉素抗性（50µg／mL）LB液体培养基，37℃，200 r／min振荡培养8 h；按1%的接种量转接至300 mL液体培养基中培养，当菌液A600为0.6～0.8时，加入终浓度为1 mmol／L的IPTG，37℃，200 r／min诱导6 h。诱导后的菌液经超声破碎，13 800×g离心2 min，收集上清和沉淀，经10%SDS-PAGE鉴定蛋白的表达，应用Image Lab 3.0软件分析蛋白的表达量。

1.7 目的蛋白的纯化 诱导表达的重组菌液于4℃，10 000×g离心30 min，收集菌体沉淀，按1∶10（W／V）比例加入PBS（pH 7.3）缓冲液重悬菌体，800 bar条件下均质3次；均质破碎后的菌液经10 000×g离心30 min，收集菌体沉淀（即包涵体）。包涵体经变性复性处理后，收集含目的蛋白的溶液，4℃，10 000×g离心30 min，收集上清液，用0.45µm滤膜抽滤，收集滤液。采用SCG纯化系统进行GST bestarose 4FF亲和层析纯化，用5个体积PBS缓冲液（pH 7.3）平衡GST bestarose 4FF介质，上样流速为1 mL／min，用含10 mmol／L还原性谷胱甘肽的50 mmol／L Tris-HCl（pH 8.0）洗脱液洗脱目的蛋白，经10% SDS-PAGE鉴定，应用Image Lab 3.0软件分析纯度。

1.8 重组蛋白的Western blot分析 纯化的重组蛋白经10%SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，用10%脱脂牛奶室温封闭1 h；PBST洗涤3次，加入TBEV全病毒感染小鼠血清（1∶1 000稀释），室温孵育2 h；PBST洗涤3次，加入山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶5 000稀释），室温孵育1 h；PBST洗涤5次，DAB显色。

1.9 重组NS1和E蛋白血清检测趋势一致性分析 采用间接ELISA法，以重组NS1和E蛋白分别作为固相抗原，检测TBEV全病毒感染小鼠不同天数血清，比较其检测一致性。分别用纯化的重组NS1蛋白和重组E蛋白的最佳包被浓度（10µg／mL）包被酶标板，4℃过夜（＞16 h）；弃上清，每孔加入200µL含10%新生牛血清的PBS，4℃封闭过夜；加入待检血清（1∶100稀释），100µL／孔，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次，加入羊抗鼠IgM-HRP（1∶5 000稀释），100µL／孔，37℃孵育30 min；PBST洗涤5次，加入TMB底物显色，100µL／孔，37℃孵育15 min；加入2 mol／L H2SO4，50µL／孔，终止反应，用酶标仪测定A450值。

1.10 重组NS1蛋白临床应用的特异性与敏感度分析 采用间接ELISA法，用重组NS1蛋白包被酶标板，小鼠抗人IgG-HRP为二抗，测定15份TBE阳性临床血清，15份流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）临床血清和25份健康志愿者血清，分析检测特异性和敏感度，评价重组NS1蛋白用于TBE临床诊断的可行性。

2 结 果

2.1 目的基因扩增产物的鉴定TBEVNS1基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 056 bp的特异性条带，大小与理论值一致，见图1。

图1 TBEV NS1基因扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of TBEV NS1 gene

2.2 重组表达质粒的鉴定 重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1转化菌落的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，7号和10号菌落呈阳性，可见1 056 bp的特异性条带，大小与理论值一致，见图2。重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，可见1 056 bp的目的基因片段和4 969 bp的载体片段，见图3，质粒测序结果正确，表明重组质粒构建正确。

2.3 表达产物的鉴定 表达的重组蛋白经10%SDSPAGE分析，在相对分子质量约65 000处可见特异性蛋白条带，大小与理论值一致，见图4。经Image Lab 3.0软件分析，重组NS1蛋白的表达量约占重组菌体蛋白的22.1%。诱导后的重组菌超声破碎物上清和沉淀中均可见目的蛋白条带，但主要以包涵体形式存在，见图5。

图2 pGEX-4T-1-NS1重组菌的PCR鉴定Fig.2 Identification of recombinant colonies with pGEX-4T-1-NS1 by PCR

图3 重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1的双酶切（BamHⅠ／XhoⅠ）鉴定Fig.3 Restriction map of recombinant plasmid pGEX-4T-1-NS1（BamHⅠ／XhoⅠ）

图4 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of recombinant protein

2.4 纯化产物的鉴定10%SDS-PAGE分析显示，纯化的重组蛋白相对分子质量约65 000，大小与预期相符，见图6。蛋白纯度为93.7%。

图5 重组蛋白表达形式的SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of form of expressed protein by SDS-PAGE

图6 纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE profile of purified product

2.5 重组蛋白的Western blot鉴定 纯化的重组蛋白可与TBEV全病毒感染小鼠血清发生特异性反应，在相对分子质量约65 000处可见反应条带，而未诱导菌体未见该条带，见图7。表明重组NS1蛋白具有良好的反应原性。

2.6 血清检测趋势一致性 间接ELISA法检测结果表明，重组NS1蛋白与重组E蛋白作为包被抗原测定TBEV全病毒感染不同天数小鼠血清特异性IgM抗体具有一致性，且NS1蛋白与E蛋白的检测吸光度值基本一致，见图8。表明重组NS1蛋白与包膜E蛋白具有较高的IgM抗体检测趋势一致性，具有应用于血清学诊断的价值。

2.7 重组NS1蛋白临床应用的特异性和敏感度 间接ELISA法检测结果显示，以重组NS1蛋白作为包被抗原测定15份TBE阳性临床血清均为阳性，敏感度为100%（15／15）；检测15份JE临床血清14份为阴性，检测25份健康志愿者血清24份为阴性，特异性为95%（38／40）。

图7 重组蛋白的Western blot鉴定Fig.7 Western blotting of recombinant protein

图8 两种固相抗原检测小鼠血清IgM抗体趋势图Fig.8 Trends of IgM determined with two solid phase antigens

3 讨论

TBE是一种中枢神经系统急性传染病。近年来，随着我国城镇化进程加快，TBE流行范围不断扩大，发病率不断上升，成为社会日益关注的公共健康问题［17］。TBEV感染常用临床辅助诊断方法包括常规的生化、血常规、脑电图检查等非特异性理化检测和脑脊液病毒分离、RT-PCR核酸检测、血清学检测等特异性方法。在特异性检测方法中，由于病毒分离周期长，生物安全防护要求高，难以实现临床常规检测；RT-PCR病毒核酸检测方法具有高通量、时间短、特异性高等优点，但由于病毒核酸可检测窗口期滞后和病毒血症期短暂，导致核酸检测敏感度较低，使得TBEV感染临床标本核酸检测手段难以发挥关键作用。血清学检测方法主要有血清抗体中和试验、血凝抑制试验（hemagglutination inhibition test，HLT）及补体结合试验（complement fixation test，CFT），其中中和试验检测过程中须用到活病毒，不适用于实验室常规检测；HLT、CFT检测双份血清效价增加4倍以上具有诊断意义，方法特异性低。ELISA法因其具有简便快速、敏感度高、可操作性强等特点，最常应用于临床辅助诊断及抗体水平的监测［18-19］。虽然TBEV包膜E蛋白是病毒主要结构蛋白，为诱导机体产生保护性抗体的主要抗原，但黄病毒属E蛋白诱导产生的抗体间存在较强的交叉反应性，用于抗体检测特异性较低，不能单独作为理想的特异性抗体检测指标［20］。因此，高特异性抗原用于临床黄病毒血清学检测在疾病辅助诊断上具有重要意义。黄病毒的NS1蛋白之间也存在交叉反应性，但研究认为，NS1蛋白比E蛋白含有更多的种特异性表位［21-22］。近来有研究显示，黄病毒的NS1蛋白可作为一种新型疫苗的靶标［14］。因此，NS1蛋白除用于疾病诊断外，在疫苗免疫效果评价方面也有待进一步研究。

本研究构建了TBEV NS1蛋白原核表达质粒，诱导表达并纯化了重组蛋白，Western blot分析显示，其与TBEV全病毒感染小鼠血清具有良好的反应原性；分别以重组NS1蛋白和重组E蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA法测定TBEV全病毒感染不同天数小鼠血清，结果表明，两种蛋白作为抗原在检测特异性抗体产生时间及吸光度值方面具有较高的一致性。采用间接ELISA法，以NS1蛋白作为固相抗原，对15份TBE阳性临床血清、15份JE临床血清及25份健康志愿者血清样本进行检测，敏感度为100%，特异性为95%，表明NS1蛋白存在作为鉴别TBEV感染与其他黄病毒感染所产生的NS1特异性抗体的可能性。

综上所述，本研究成功构建了TBEV重组NS1蛋白，以其为包被抗原，经间接ELISA法测定临床血清，显示出良好的特异性和敏感度，表明重组NS1蛋白存在作为ELISA检测中的一种特异性包被抗原，并用于鉴别诊断TBEV感染与其他黄病毒感染的可能性，为进一步开发TBE诊断试剂及完善黄病毒NS1蛋白研究奠定了基础。