去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素纯化液中内毒素TritonX-114液相分离法的建立及其效果评价

温嘉纳，王虓宇，张光贤，陈林涛，张晓华，赵宸，李娜，孙明波，梁疆莉

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明 650118

百日咳疫苗生产过程中，细菌会产生大量内毒素，内毒素是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，该成分称为脂多糖，破碎细菌获得蛋白抗原的同时，细胞壁的内毒素会释放至蛋白溶液中。《欧洲药典》8.0版中规定，无细胞百白破-脊髓灰质炎联合疫苗的内毒素含量应＜100 EU／剂［1］，根据该要求推算百日咳疫苗中丝状血凝素（filamentous hemagglutinin，FHA）、百日咳毒素（pertussis toxin PT）及69 kD外膜蛋白（pertactin，PRN）3种原液的内毒素含量应均＜100 EU／mg，因此必须采取合理有效的方法去除内毒素。

通常去除内毒素的方法有化学萃取法（如TritonX-114液相分离法）和离子交换层析法（如离子交换层析）［2-3］。TritonX-114液相分离法经济高效，已广泛应用于生物制品中内毒素的去除［4-5］。1990年，AIDA等［6］采用Triton X-114液相分离法去除重组蛋白溶液中的内毒素，随后有研究采用该方法去除其他生物制品中的内毒素，效果均较好［7-8］。TritonX-114是一种非离子型表面活性剂［9-11］，在低温时成水溶性，温度升高后变为脂溶性，具有较低的临界胶束浓度，于4℃可与水溶液互溶，并与脂多糖分子结合；25℃以上能携带脂多糖分子从水相中析出。利用TritonX-114的特性，本研究建立适合于百日咳疫苗FHA纯化液去除内毒素的TritonX-114液相分离法，并评价其去除效果。

1 材料与方法

1.1 纯化液 无细胞百日咳疫苗FHA纯化液（批号：20200901-01、20201101-01、20201101-02、20201101-03）由中国医学科学院医学生物学研究所制备。

1.2 主要试剂TritonX-114及Lowry蛋白测定试剂盒均购自北京Solarbio公司；内毒素鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司。

1.3 正交试验FHA纯化液（20200901-01）中加入一定浓度的TritonX-114，4℃振荡混匀，37℃静止分层，经16 743×g离心后，含有内毒素的液相位于下层，提取上层液相，去除下层液相，达到去除内毒素目的。根据TritonX-114液相分离法所需条件，设计4因素［TritonX-114加入量（A）、4℃混匀时间（B）、37℃分层时间（C）、25℃16 743×g离心时间（D）］及3水平，共12组正交试验，见表1和表2。以纯化液回收率作为因变量确定各因素的最佳值。应用SPSS 17.0软件进行数据正交设计、线性模型单变量分析、主体间效应检验、四因素同回收率检验，依据纯化液蛋白回收率及P值结果，确定最佳内毒素去除条件（以P＜0.05为差异有统计学意义）。

表1 正交试验因素及水平Tab.1 Factors and levels in orthogonal test

表2 正交试验设计Tab.2 Design of orthogonal test

1.4 内毒素去除效果的评价 以正交试验确定的最佳条件去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液（批号：20201101-01、20201101-02、20201101-03）的内毒素，检测去除内毒素后纯化液的FHA蛋白含量、内毒素含量及TritonX-114残留量。同时将去除内毒素前后的FHA纯化液进行10%SDS-PAGE分析。

1.5 内毒素及FHA蛋白含量的检测 分别按照《中国药典》三部（2015版）中细菌内毒素检测凝胶法及Lowry蛋白检测法进行检测［12］。

1.6 TritonX-114残留量检测 参照文献［13］的浊度法检测样品的TritonX-114残留量，其原理为TritonX-114与苯酚反应可产生一定浊度的复合物，浊度与TritonX-114的浓度成正比，通过测定A340计算TritonX-114残留量。

2 结 果

2.1 正交试验结果 加入不同TritonX-114的FHA纯化液蛋白回收率差异有统计学意义（P＜0.05），其中，加入量为1%时蛋白回收率最高，因此选择1%为最佳TritonX-114加入量。随着4℃混匀时间、37℃分层时间、25℃16 743×g离心时间的变化，纯化液回收率差异均无统计学意义（P＞0.05），当4℃混匀时间为30 min，37℃分层时间为60 min，25℃167 43×g离心时间为10 min时，蛋白回收率最高，见表3和表4。因此确定该条件为最佳检测条件。

2.2 内毒素去除效果20201101-01、20201101-02、20201101-03批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液在最佳条件下去除内毒素后，内毒素含量均＜0.25 EU／mL，去除率均＞99%；TtitonX-114残留量均值为0.183%；蛋白回收率均值为91.04%。见表5。表明FHA生物活性在去除内毒素前后无变化。10%SDS-PAGE分析显示，去除内毒素前后FHA纯化液均可见相对分子质量约220 000的目的蛋白条带，大小与预期相符，纯度＞95%，符合FHA纯化液的纯度要求，见图1。

表3 正交试验结果Tab.3 Result of orthogonal test

表4 正交设计的方差分析表Tab.4 Variance analysis of orthogonal design

表5 去除内毒素后无细胞百日咳疫苗FHA纯化液的检测结果Tab.5 Test result of purified FHA of acellular pertussis vaccine after removal of endotoxin

图1 FHA纯化液的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE profile of purified FHA

3 讨 论

本研究通过正交试验确定了TritonX-114去除百日咳疫苗FHA纯化液中内毒素的最佳条件为：TritonX-114加入量为1%，4℃混匀时间为30 min，37℃分层时间为60 min，25℃16 743×g离心时间为10 min。采用优化的最佳条件去除无细胞百日咳疫苗FHA纯化液中的内毒素后，内毒素含量＜0.25 EU／mL，优于《欧洲药典》8.0版中对内毒素要求［1］；蛋白回收率为91.04%，且SDS-PAGE纯度较高。

本课题组前期研究采用柱层析法去除FHA原液内毒素，结果表明，使用Capto adhere层析柱可将FHA纯化液中内毒素降至100 EU／mL以下，蛋白回收率＜75%［14］，且在该方法操作中需考虑抽提物的质量浓度、层析法的缓冲体系、pH条件、柱床比例、流速等诸多因素。与该结果比较，本研究采用TritonX-114液相分离法在内毒素去除及蛋白回收率上占有一定优势，且缩短了处理时间，简化了处理流程。同时TritonX-114液相分离法由于投入成本低，涉及物料简单，可较好地控制研发生产成本，减少环境污染。

《中国药典》三部（2015版）中未对TritonX-114残留量进行规定，参照重组乙型肝炎疫苗半成品对表面活性剂TritonX-100的含量要求（＜15µg／mL），TritonX-114对FHA原液抽提后残留量＜1 ng／mL，远低于该版《中国药典》中其他疫苗的要求［12］。有报道表明，以TritonX-114液相分离法提取的RNA对BALB／c小鼠无不良反应，对家兔也无发热作用［15］，表明TritonX-114具有较好的安全性。

综上所述，采用TritonX-114液相分离法去除无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素，内毒素可降低至0.25 EU／mL，且TritonX-114残留量＜1 ng／mL，该方法具有良好的应用前景。另外，TritonX-114是否适用于无细胞百日咳疫苗其他两组分PT及PRN内毒素的去除有待进一步深入研究。