Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒

钏鸿云，阮朝列，莫明和，王静，王多义，朱莲海，刘云璨，廖国阳，周健

1.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 云南 昆明 650118；2.云南大学省部共建云南生物资源与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091

Vero细胞是来源于非洲绿猴肾细胞的传代细胞系，WHO推荐用于人用疫苗的生产［1］，其来源方便、生长速度较快、易于培养、在170代以内不致瘤，并可在生物反应器中通过微载体和悬浮培养方式进行工业化生产［2-3］。微载体细胞培养法是一种用于培养贴壁依赖性细胞的大规模培养技术［4］，与单层细胞培养相比，该方法可为贴壁细胞提供更大的培养表面积，从而大幅增加细胞产量，且易于控制，可降低污染风险［5］。无血清培养基加入成分明确的血清替代品，既能满足细胞的培养要求，还能提高细胞培养和实验结果的重复性，稳定了批间的质量，避免了血清对细胞的毒性作用和血清源性污染及血清组分对实验研究的影响，且获得的细胞产品易于后续纯化［6-9］。

流感病毒增殖过程中，需要加入TPCK-胰酶使血凝素前体蛋白（haemagluttinin precursor，HA0）裂解后才具有感染性［10］，若培养液中加入血清，会对TPCK-胰酶产生中和作用，使其无法裂解流感病毒HA0，导致流感病毒对细胞的感染性降低甚至消失［11］。因此，本研究旨在研发Vero细胞生物反应器微载体无血清培养流感病毒的相关技术，以期用于Vero细胞流感疫苗的规模化生产。

1 材料与方法

1.1 细胞及病毒Vero细胞P134购自欧洲动物细胞收藏中心（编号：03129010），传代至P141制成工作细胞库，由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存；H1N1型流感病毒Vero细胞高产适应株A／上海嘉定／SWL1970／2015VA（H1N1）毒种由该室重配并保存。

1.2 主要试剂及仪器ProVero细胞无血清培养基购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；小牛血清购自北京民海生物科技有限公司；青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺溶液、DMEM培养基、TPCK-胰酶及NaHCO3溶液均由中国医学科学院医学生物学研究所中心供应室配制提供；3 L生物反应器购自荷兰Applicon公司；Countstar细胞计数仪购自上海睿钰生物科技有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 细胞培养液 无血清Vero细胞培养液：以ProVero为基础培养基，补加1%青霉素-链霉素溶液及2%谷氨酰胺溶液。有血清Vero细胞培养液：以DMEM为基础培养基，添加10%小牛血清、1%青霉素-链霉素溶液、2%谷氨酰胺溶液，用6.6%NaHCO3调整pH约7.2。

1.3.2 病毒维持液 以ProVero为基础培养基，添加1%青霉素-链霉素溶液及2%谷氨酰胺溶液，TPCK-胰酶终浓度1µg／mL，用6.6% NaHCO3调整pH为7.8～8.0。

1.4 Vero细胞培养Vero细胞复苏后，采用传统细胞培养方式对细胞扩增后，进行生物反应器培养。将生物反应器参数设定为：pH 7.2，温度37℃，溶氧量50%，转数60 r／min，预培养约24 h稳定后，按1.5×104个／mL的密度将Vero细胞接种至生物反应器中进行微载体培养。其中组1用1 L无血清培养液培养，补加无血清培养液至1.5 L，培养24 h；补加无血清培养液至2 L，培养24 h；起始培养后5、6、7 d，按1 L／d无血清培养液进行灌流培养，每天取样计数。组2用1 L有血清培养液培养Vero细胞24 h后，更换为无血清培养液1.5 L，培养24 h；补加无血清培养液至2 L，培养24 h；起始培养后5、6、7 d，按1 L／d无血清培养液进行灌流培养，每天取样计数。

1.5 H1N1型流感病毒培养及收获 两组Vero细胞培养至7 d，补加病毒维持液500 mL，按MOI=0.1的病毒量将H1N1型流感病毒接种于长满单层的Vero细胞，加入1µg／mL的TPCK-胰酶，于pH 7.8，温度33.0℃，溶氧量25%，转数60 r／min的条件下吸附1 h；补加病毒维持液至2 L，调整培养参数为：pH 7.4，温度33.0℃，溶氧量25%，转数60 r／min，进行病毒培养。每天取样，72 h后按每批2 L收获病毒液，进行镜检及血凝效价检测［11］，试验重复5次，取血凝效价几何平均值。

1.6 统计学分析 应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，试验数据采用均值±标准差（）表示，细胞计数结果组间比较采用配对t检验，病毒效价组间比较采用方差分析，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 微载体上Vero细胞的生长情况

2.1.1 镜下观察 培养6 h后，两组Vero细胞均已贴壁，但组1细胞未进入分裂期；组2细胞形态已复原，伸长为梭状，开始进入分裂期。培养至24 h时，两组细胞均已贴壁并呈长梭形贴附于微载体上，开始进行细胞增殖。见图1。

2.1.2 细胞计数Vero细胞随培养时间的延长，数量呈上升趋势，培养7 d时，组1和组2的细胞数分别为（133.4±2.0）×104和（193.8±1.3）×104个／mL，均明显高于培养0 d的细胞数（t分别为18.470和13.500，P＜0.05）。且培养7 d时，组1细胞数明显低于组2（t=7.068，P＜0.05）。见图2。

2.2 H1N1型流感病毒增殖情况

2.2.1 镜下观察 培养18～22 h内两组均未见典型的细胞病变，出现的部分细胞拉网、脱落情况可能是TPCK-胰酶作用导致的。培养48 h时，两组均可见细胞皱缩、变圆，附着于微载体表面，随后细胞破碎脱落，为比较典型的细胞病变情况；培养至66 h，大部分细胞已破碎脱落。见图3。

图1 不同培养基培养Vero细胞生长情况的镜下观察（×200）Fig.1 Microscopy of growth of Vero cells cultured in different media（×200）

图2 Vero细胞生长曲线图Fig.2 Growth curve of Vero cells

图3 病毒培养66 h情况的镜下观察（×200）Fig.3 Microscopy of virus cultured for 66 h（×200）

2.2.2 效价 两组H1N1型流感病毒培养66 h时的血凝效价几何平均数分别为1∶388和1∶675，组1显著低于组2（F=4.332，P＜0.05），见表1。均可完全满足流感病毒裂解疫苗制备的要求。

表1 不同培养方式培养不同时间病毒的血凝效价Tab.1 Hemagglutination titers of virus cultured under various conditions for various hours

3 讨 论

Vero细胞培养是一种贴壁培养方式，历经了从实验室方瓶培养至规模化转瓶培养的发展过程。为提高其生产效率，实现Vero细胞的规模化生产，需采用微载体进行培养［12］。目前，微载体细胞培养工艺已应用于肠道病毒71型、流感病毒、呼肠病毒、脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒、新型冠状病毒等多种病毒的培养［13-14］。

由于血清成分复杂，批间差异较大，特别是在发生人畜共患的突发性传染病时，如使用含有相应病原体抗体的血清进行相应疫苗的研发和生产时，会延长研究和生产的过程，阻碍人类抵抗疾病的进展。目前，已上市使用无血清培养基培养Vero细胞制备的生物制品，主要是通过静置有血清培养，该培养方式产量受限，不易扩大规模［15-17］。因此，本实验分别采用无血清和有血清培养基培养Vero细胞，培养24 h后，均用无血清灌流培养细胞至7 d，最终浓度分别为（133.4±2.0）×104和（193.8±1.3）×104个／mL，前者显著低于后者（P＜0.05）。根据细胞生长曲线选择细胞转入平台期的拐点（7 d）来进行H1N1型流感病毒的培养，病毒培养至66 h，两组病毒的血凝效价几何平均数分别为1∶388和1∶675，前者显著低于后者（P＜0.05），但均可完全满足流感病毒裂解疫苗制备的要求。

综上所述，采用Vero细胞通过生物反应器微载体无血清培养流感病毒具有可行性，本实验为Vero细胞流感疫苗的规模化生产奠定了基础。课题组今后将对微载体生物反应器更大规模无血清培养Vero细胞和流感病毒进行进一步深入研究。