地龙多肽舒缓修护功效评估研究

何海鸥，史林艳

（珠海伊斯佳科技股份有限公司，广东珠海 519000）

地龙为钜蚓科动物参环毛蚓 Pheretima aspergillum （E.Perrier）、通俗环毛蚓 P.vulgaris Chen、威廉环毛蚓 P.guillelmi （Michaelsen）或栉盲环毛蚓P.pectinifera Michaelsen 的干燥体[1]。可入药，该药材在我国已有悠久的使用历史，其性寒，味咸，归肝、脾、膀胱经，具有清热止痉、平肝熄风、通经活络、平喘利尿的功效；用于治疗高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肺热喘咳、尿少水肿、高血压等症[2]。地龙的化学成分主要包括：氨基酸类化合物、核苷类化合物、二肽类化合物、有机酸类化学物、无机元素、蛋白类化合物及其他类[3]。其有非常多的药理作用：抗炎镇痛、治疗哮喘、化痰止咳、镇静催眠及抗惊厥、预防糖尿病肾脏疾病、促进创伤愈合、降脂等。其中抗炎镇痛和促进创伤愈合的功效让其可应用在舒缓类的化妆品中，在《已使用化妆品原料名称目录》（2021 版）中有参环毛蚓提取物，本文通过诱导人体皮肤红斑模型法和开放使用法两种评价方法，探究地龙多肽DHEPP舒缓和修护皮肤的功效。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

地龙多肽DH-EPP，INCI中文名：参环毛蚓提取物，疏松淡黄色粉末（重庆东寰科技提供）；十二烷基硫酸钠（SLS，分析纯99%）；10%乳酸溶液；精华A（不含地龙多肽DH-EPP），精华B（含0.5%地龙多肽DH-EPP）（精华A和B其他成分均相同，且不含其他舒缓修护功效成分）；皮肤经皮水分流失测试仪（Delfin）；皮肤肤色测试仪（Delfin）；皮肤分析仪（visia 7）；温湿度记录仪；斑试器，分析天平。

1.2 测试环境

温度（21±1）℃，湿度40 %～ 60%。

1.3 实验方法

1.3.1 诱导人体皮肤红斑模型法

在封闭性的条件下，用3%十二烷基硫酸钠（SLS）溶液斑贴作用于皮肤24h，待斑贴去除后，利用人工诱导皮肤红斑反应。通过测量皮肤在诱导后及使用产品后不同的皮肤参数（如经表皮失水率和皮肤红色素），评价产品舒缓修护功效。

1.3.1.1 研究对象

受试者纳入应符合以下标准：18~60 岁的健康成年人；无严重慢性消耗性疾病（如哮喘、糖尿病等），无皮肤病变、炎症、湿疹等；双前臂屈侧皮肤完好，没有任何疤痕，损伤，肤色不均等影响评估因素；近一月内未曾使用激素类药物及免疫抑制剂者；最近三个月受试部位未参加其他临床试验者；孕期或哺乳期的女性应排除在外；测试前签署志愿者知情同意书。

1.3.1.2 诱导人体特应性皮炎模型

根据要求招募33名受试者，受试者应在测试环境中休息30min后再开展测试。在受试者双前臂屈侧处，根据随机要求在左或右前臂屈侧标记受试区域，受试面积不得少于3cm×3cm。受试区域根据随机选择分为对照组、测试组区域。将0.020~0.025mL的诱导物（质量分数为3%的SLS溶液）置于滤纸片，放入斑试器小室内。将加有诱导物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的预设受试区，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h[4]。在移除斑试器后的6h为皮肤红斑诱导反应期，不进行任何处理。

1.3.1.3 指标测定

由专业研究员对受试者诱导受试部位的皮肤状况进行询问和检查，最终纳入31人，完成测试31人。

受试者按要求在各红斑反应测试区使用产品，早晚各一次，连续使用测试产品10d，在使用产品后5d±1d、10d±1d对经皮失水量、皮肤红区a*值进行回访测试，并记录。

1.3.2 人体开放使用法

通过乳酸刺痛测试筛选出皮肤不耐受人群，通过测量皮肤使用产品前及后不同的皮肤参数（经皮失水量和皮肤红区面积），评价产品舒缓修护功效。

1.3.2.1 研究对象

受试者纳入应符合以下标准：乳酸刺痛试验筛选呈阳性者；受试者处于敏感肌的非发病期；颜面部皮肤完好，没有任何疤痕，损伤，肤色不均等影响评估因素；其他基础条件同红斑模型法。

1.3.2.2 半主观评价乳酸刺痛试验

在测试环境下，将50µL 10%乳酸溶液涂抹于鼻唇沟，分别在涂抹后2.5min和5min时询问受试者的自觉症状，按4分法进行评分（0分为没有刺痛感，1分为轻度刺痛，2 分为中度刺痛，3 分为重度刺痛），并将两次分数相加，总分≥3分者为乳酸刺痛反应阳性。纳入乳酸刺痛试验阳性受试者33人，最终完成测试31人（其中有2人因个人原因退出）。

1.3.2.3 指标测定

使用面部图像分析仪对颜面部进行图像采集分析皮肤红区面积，利用皮肤探头测量皮肤经皮失水量，并将测试数据记录。受试者按要求半脸使用不同产品，样品组（精华B）与对照组（精华A）随机分布，早晚各一次，连续使用产品28d，在使用产品后14d±1d、28d±1d进行上述指标测试，并再次进行乳酸刺痛试验。

1.4 统计分析

计算分析参数的初始值/其他测量时间点/其他组间的数值，使用专业统计软件SPSS21.0进行分析。如数据呈正态分布，采用 t 检验或方差分析方法进行数据分析统计；如数据呈非正态分布，采用秩和检验方法进行统计；统计方法均采用双尾检验，检验水平α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 诱导人体皮肤红斑模型法

用3% SLS溶液诱导手臂内侧皮肤红斑，基于仪器测量经皮水失水量（TWEL）如表1所示。

表1 手臂经皮失水量（g·m-2·h-1）差异性分析

从上述数据可知，不管使用精华A或精华B，红斑区的经皮失水量在第5d和第10d都显著降低（P＜0.05），皮肤存在自身修护作用；使用精华B的部位经皮失水量显著低于精华A，在第5d和第10d改善率分别达到49.19%（P＜0.001），57.38%（P＜0.05），在第10d的经皮失水量已恢复至建模前的状况，说明添加了地龙多肽的精华B有更好的舒缓修护的功效。

用皮肤颜色测试仪测试代表红区的皮肤a值，a值越小，说明红区改善效果越明显，测试结果如表2所示。

表2 手臂皮肤a值差异性分析

从上述数据可知，使用精华B的部位在第5d与建模6h的基值相比就表现出了非常显著的改善（P＜0.001），精华A和精华B在使用第5d和第10d红区效果改善均有显著性差异，说明精华B有较好的改善皮肤红区的效果。

2.2 人体开放使用法

通过产品使用前后半主观评价乳酸刺痛试验评分、皮肤经皮失水量和visia图像分析皮肤红区面积的变化情况来评估舒缓和修护效果，数据如表3所示。

由上述数据可知，从乳酸刺痛试验评分、经皮失水量和皮肤红区面积几个指标来看，使用精华B 28d后与精华A相比，效果都有显著性差异（P＜0.05），说明在人体开放使用法中，添加了地龙多肽的精华B对皮肤有更好的舒缓修护效果。

3 结论

研究表明，通过诱导人体皮肤红斑模型法和开放使用法评估添加了0.5%地龙多肽DH-EPP的精华对皮肤舒缓修护的功效，在两种人体功效评价方法中，该精华与对照组相比，都表现了显著性的舒缓修护效果，且两种方法测试的趋势一致。

表3 产品使用前后皮肤各测量指标的差异性分析

4 讨论

中药地龙资源丰富，其蛋白多肽类成分含量高、毒性低，具有多方面的药理作用，国内外学者对地龙蛋白多肽类成分的研究也日益深入和广泛，并开发出多种地龙蛋白多肽类产品，如地龙活性蛋白胶囊、地龙蛋白溶血栓胶囊、蚓激酶肠溶胶囊、多肽地龙蛋白等[4]。地龙多肽DH-EPP可溶解在水中，采用了特殊的酶解工艺，低温分离制备，多肽分子量在5000道尔顿以下，具有高生物活性。本文通过诱导人体皮肤红斑模型法和开放使用法对比评估添加了0.5%地龙多肽DH-EPP的精华B和不添加地龙多肽的精华A对皮肤的舒缓修护效果，在两种测试方法中，测试的结果趋势一致，说明地龙多肽DH-EPP有比较好的舒缓修护效果，为进一步扩展地龙多肽在化妆品中的应用提供了基础。