猪圆环病毒2 型检测技术研究进展

陈 旭，汤德元，杨志刚，晏仁潭，韩超逸，罗 柳，陈阊峥，袁盛林，廖正波

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属圆环病毒科、圆环病毒属，病毒基因组为单股负链环状DNA，病毒呈二十面体对称，无囊膜结构，是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒1 型（Porcine Circovirus 1，PCV1）和有致病性的猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus 2，PCV2），猪圆环病毒3 型（Porcine Circovirus 3，PCV3），猪圆环病毒4 型（Porcine Circovirus 4，PCV4）。PCV2 主要侵害机体的免疫系统，引起机体继发感染断乳仔猪多系统衰竭综合征（post-weaning multisystem wasting syn-drome，PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（porcine dermatitis andnephropathy syndrome，PDNS）、猪呼吸道病综合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）、母猪繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、仔猪先天性震颤等疾病。2000 年，我国首次报道了PCV2 感染。目前，PCV2 感染在我国猪群中广泛流行，种猪有很高感染率，与其他疾病混合感染现象严重。PCV2 现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病病原，因此建立即时有效的检测PCV2 的技术方法尤为重要，文章综述了多种PCV2 检测技术，旨在为养殖场PCV2 有关疾病的检测防控提供技术支持。

1 病毒分离培养

PCV2 可选用猪肾细胞、PK-15细胞、猪睾丸细胞等来进行分离培养，取病死猪的淋巴结组织研磨，加PBS 缓冲液制成悬液，-20℃反复冻融3 次后离心取上清液，经过滤器过滤除菌，接种易感细胞，置于37℃培养箱，盲传1～3 代后进行PCV2 抗原或核酸检测加以鉴定。何锡忠等利用有限稀释法从含猪PCV2 的PK15 细胞中克隆得到1 株 含PCV2 高 感 染 比 例 的PK15-A8 细胞株，将该克隆株在细胞瓶中静置培养，连续传代40 代后病毒滴度最高可达107.5TCID50/mL，用生物反应器培养病毒滴度最高可达108.0TCID50/mL 以上。郭光富等将阳性病料悬液经0.22 μm 滤膜过滤后接种PK15 细胞，连续盲传5 代后收取细胞病毒液并提取DNA，通过PCR 检测及间接免疫荧光（IFA）鉴定出分离株为PCV2，并命名为TAIZ110926 株。Cruz TF等将PCV2 接种到添加有d-氨基葡萄糖的猪睾丸细胞中，并使用shell小瓶技术对其进行培养，经历15 次传代后，RT-PCR 监测结果显示，该方法比传统吸附法获得的DNA量高出2 倍。病毒分离培养可以观察到病毒接种细胞后产生的细胞病变，但此方法首先需要培养出状态较好的病毒易感细胞，这个过程比较耗时，操作过程中容易遭到污染，且血清成本高，因此不适用于常规检测。

2 电镜观察

电子显微镜是用电子束代替可见光的显微装置，一种高放大，高分辨的大型精密仪器。电镜检测技术主要有扫描电镜和透射电镜，扫描电镜主要通过发射电子聚焦光束来扫描PCV2 样品的表面形态确定病毒，透射电镜则是通过电子束穿透组织和细胞来观察PCV2 感染细胞内的超微结构来检测病毒。将待检组织样本通过固定，脱色，包埋，切片，染色等步骤制成超薄切片，在电子显微镜下通过调节放大倍数进行电镜观察。Liu Z 等使用29 nm（2.9 Å）分辨率的单颗粒冷冻电子显微镜观察到PCV2 的1.67 MDa 病毒样颗粒。电镜法具有直观，快捷等优点，但是电子显微镜设备价格较高，且该法只能观察病毒的外观形态，很难与同科的病毒相区别。

3 分子生物学检测

3.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA 半保留复制原理，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，并设计特异性引物做启动子，加入DNA 聚合酶、dNTP，从而完成特定基因的体外复制。这是一种快速，灵敏，特异性强，对样本纯度要求较低的病原学检测方法。在普通PCR 的基础上，发展出了多种形式的PCR 技术，包括实时荧光定量PCR、多重PCR、数字微滴PCR、其他PCR 等。

3.1.1 常规PCR

通过提取待测样品的DNA，将DNA 加入合适的PCR 反应体系中，调节反应温度进行扩增，从而获得目的基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测所获条带是否符合目标条带。苗丽娟等通过Genbank对猪PCV2 基因的序列进行分析，用Primer 5.0 设 计 了ORF2 基 因的扩增引物，引物的序列为P1：5′-GTCCTGGTCGTATITACTGT-3′；P2：5′-GTCACAACGCCCTCCTG-3′。首先将需要检验的病料冻融1～2 次后使用灭菌剪刀将病猪的脾脏、淋巴结、扁桃体等器官剪下小块，将其剪碎后加入PBS 缓冲液进行研磨，倒入离心管中离心取上清，提取DNA，按照设计的PCR 反应体系加入所需试剂及DNA 进行PCR扩增，获得447 bp 大小的ORF2 基因片段，敏感性检验分析表明检测样本DNA 浓度最低可达到9.8×10-4ng/μL，且PCR 反应具有良好的稳定性和重复性。

3.1.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（qPCR）是一种在DNA 扩增反应中，以荧光化学物质测定每次PCR 循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA 序列进行定量分析的方法。吴叶好等建立了PCV2 质粒的荧光定量PCR。使用其所在实验室构建并保存的感染性克隆质粒pcDNA3.1（+）-PCV1-2m-V5 作为模板，根据该质粒的测序结果，设计1 对荧光PCR引 物（ORF2-V5 F1/R1） 和 探 针（ORF2-V5-Probe）， 经 过 对 荧 光PCR 反应体系进行优化后，确定以20 μ L作为反应体系，优化后的反应体系为10 μ L 2×T5 Fast qPCR Mix（Probe），6.8 μ L ddH2O，F2／R2 各0.8 μ L，0.6 μ L探针，1.0 μ L模板。反应条件：95℃ 2 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s，设置40 个循环。该方法的最低检测浓度可达1.29×101copies／μ L，且特异性和重复性试验结果判定均为良好。

3.1.3 多重PCR

多重PCR 是在同一PCR 反应体系里加上2 对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR 相同。庞歌等为了建立PCV1 和PCV2 混合感染快速检测的PCR 方法，根据GenBank 已发表PCV1 和PCV2 全基因组序列，设计合成4 条引物，通过构建它们的阳性质粒、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验，建立了PCV 多重PCR 检测方法，可扩增出PCV1 和PCV2 长度分别为726 bp和433 bp 特异性基因片段。结果显示，建立的PCV 多重PCR 可检测到50 个拷贝的PCV1 和PCV2 目的基因，具有良好的特异性和敏感性。对现场42 份疑似PCV2 阳性的样本进行检测，结果表明PCV1、PCV2的阳性率分别为33.3%和45.2%，其中PCV1 和PCV2 混合感染阳性率为16.6%。

3.1.4 数字微滴PCR

数字PCR 能够对核酸进行定量分析，通过将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或等于1 个，这样经过PCR 循环之后，有1 个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号，根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。数字微滴PCR（ddPCR）因其高灵敏度、强抗干扰性和绝对定量等优点被广泛应用于动物病毒的检测。ddPCR 与qPCR最大的不同点在于通过乳化方式获得大量的独立微小反应体系，使抑制剂以及其他杂质对扩增效率的影响大大削弱，提高了检测的稳定性和灵敏度。同时它的绝对定量不需要依赖标准曲线来获得，省下了制备及检验标准品的时间。吴朦晨等针对PCV2 ORF1 基因设计引物和探针，通过对引物探针浓度、退火温度以及荧光阈值等条件的优化，确定反应体系中引物和探针终浓度分别为0.7 μmol/L 和0.25 μmol/L，且退火温度为59 ℃时，建立了具有最佳的扩增效率的PCV2 的ddPCR检测方法。经过特异性、灵敏性和重复性试验，表明该检测体系灵敏度相比传统qPCR 方法高出10 倍以上，对PCV2 的最低检测浓度可达2.93 拷贝/μL。

3.1.5 其他PCR

随着纳米技术在生命科学领域的逐步渗透，采用纳米颗粒与PCR技术相结合，可以去除非特异性扩增、提高反应灵敏度。梁琳等建立了一种同时检测PCV2 和PCV3的双重纳米PCR（nano-dPCR）方法，该方法对PCV2 和PCV3 两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6 拷贝/μL，其敏感性比普通PCR 高100 倍，该方法的特异性和敏感性良好，为PCV2 和PCV3早期感染进行快速、敏感的鉴别诊断提供了新方法。大量研究表明纳米材料由于其特殊的理化性质，能够和DNA 分子进行非共价结合。HUANG Y 等开发了一种基于超敏纳米颗粒DNA 探针的PCR 测定法（UNDP-PCR）用于PCV2 检测，该测定的灵敏度是传统PCR 的500 倍，检测限为血清中纯化的PCV2 DNA的2 个拷贝和PCV2 的10 个病毒拷贝，此法能可靠地排除基于抗体检测的假阴性结果，为现场PCV2 感染提供了无核酸提取，特异性强，超敏感，经济快速的诊断方法。

3.2 环介导等温扩增法

环介导等温扩增法（LAMP）是2000 年时开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，在恒温条件保温30～60 min，即可完成核酸扩增反应。QIU X 等建立了一种LAMP 方法来检测PCV2 的2a、2b 基因型，使用此法最低可以检测出1 个拷贝的病毒粒子，且与PCV2c 无交叉反应，为PCV2a和PCV2b 感染的大规模检测提供了更灵敏特异的手段。廖帆等建立了PCV2 LAMP 可视化检测方法，试验根据PCV2 ORF1 基因中的保守序列设计合适的LAMP 引物对，63℃恒温扩增45 min 即可出现梯形条带，检测下限为1.0×101copies/L，较普通PCR 敏感性提高100 倍，在产物中加入SYBR Green Ⅰ染料后可实现可视化检测，对72 份临床样品进行检测，PCV2 阳性率为47.2%（34/72），与qPCR 检 测 的 符合率为98.6%，与普通PCR 的符合率为94.4%。此法的灵敏度高，特异性强，且不需要电泳，可以进行室外检测，但反应需要的仪器价格昂贵，检测成本较高。

3.3 重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增（RPA）技术使用重组酶与引物结合形成的复合物能在模板上寻找同源序列，定位后就会引发链交换反应并启动DNA 合成对模板上的目标区域进行指数式扩增。为了能获得不依赖于琼脂糖凝胶电泳且更快速的核酸扩增方法，Yang Y 等针对PCV2 ORF2 基因开发了使用实时荧光检测（PCV2 实时RPA 测定）和RPA结合侧流试纸（PCV2 RPA LFD 测定）的两种测定方法。这两种测定方法均可在37℃ 20 min 内可检测出每个反应的病毒拷贝数，对PCV2具有高度特异性和灵敏性。Wang J等开发了一种实时重组酶聚合酶扩增（RPA）测定法，该测定仅检测PCV2，没有与猪中重要的其他病原体发生交叉反应，以PCV2 DNA为模板，实时RPA 的分析灵敏度为103个拷贝，通过测试38 个现场样品并与实时PCR 进行比较，检测结果显示具有100%诊断一致性，表明实时RPA 测定为快速，简单和可靠地检测PCV2 提供了一种替代工具，特别是在没有专业设备仪器的偏远农村地区。

3.4 重组酶辅助扩增

重组酶辅助扩增（RAA）是一种等温核酸扩增技术，可以在恒温下快速扩增靶基因片段，使用带有相应抗体的试纸可以目视检测标记有特定分子的扩增产物。Chen W 等开发了RAA 技术与核酸试纸相结合（RAA 试纸）的检测技术。该试纸条可以检测到低至103拷贝/μL 含有PCV2 ORF2 基因片段的重组质粒，病毒DNA 和病毒滴度的最低检测限为6.7×10-6ng/μL和10 TCID50/mL，由于具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作方法简单等优点，所以PCV2 RAA 试纸适用于PCV2 现场的快速临床检测。

3.5 原位杂交法

原位杂交法（ISH）是指用特定标记的已知序列核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定量定位的过程。Hansen MS 等用原位杂交法（ISH）检测PCV2 的核酸，在受PMWS 影响的猪中，20 头猪胸腺样本中有19 份检测结果为阳性，阳 性 率 为95%。Baró J 等 在96 头患有肠道疾病并提交尸检的猪中，72 头猪通过原位杂交（ISH）显示PCV2 呈阳性，阳性率为75%。

3.6 其他分子生物学方法

光学表面等离子体共振（SPR）免疫测定法是一种非破坏性、无标记、实时的检测方法。SPR 是一种物理光学现象，SPR 信号随金属表面折射率的变化而变化，通过SPR角的生物反应过程的动态变化可以获得生物分子相互作用的特定信号。Hu J 等基于表面等离子体共振（SPR）并建立了特殊的分子鉴定膜，研究了一种灵敏且无标记的分析方法，用于检测血清样品中PCV2。SPR 生物传感方法的理论检测限计算为0.04 μg/mL。相应地，回收率从81.0%到89.3%不等，与PCV2检测试剂盒相比，该表面等离子体共振生物传感系统通过线性度、精度和恢复率进行了验证，证明了表面等离子体共振免疫测定是可靠和稳健的。

4 免疫学检测

4.1 酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定（ELISA）方法是利用抗原抗体之间专一性结合的特性，通过特异性显色反应对抗原或抗体进行检测。该方法具有特异性高、操作简便、耗时少、结果便于观察等优点，目前被广泛研究和应用。常见的ELISA 检测方法有：间接ELISA，双抗夹心ELISA，竞争性ELISA。

4.1.1 间接ELISA

间接ELISA 是用可溶性抗原包被于固相载体，洗涤，加入含有被测抗体的标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色，即可测出待测抗体的量。栗利芳等建立了PCV2 合成肽间接ELISA 抗体检测方法。试验通过对国内PCV2 流行毒株的序列测定并结合猪圆环疫苗毒株序列，化学合成可能的抗原位点肽段，通过血清学试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到免疫原性较高的肽段，通过120 份PCV2 阳性血清筛选，选取出4 条肽段混合作为包被抗原，建立了间接ELISA 抗体检测方法。进一步试验可见建立的间接ELISA 方法敏感性为95.0%，特异性为97.5%，重复性稳定性好。PCV2 自然感染和疫苗免疫都产生PCV2 Cap 抗体阳性的结果，因此它们无法诊断免疫猪场中的PCV2感染，CHEN Q 等建立了一种非结构蛋白（Rep’蛋白）抗体检测方法，该方法可区分自然感染产生的抗体和疫苗免疫诱导的抗体。

4.1.2 双抗夹心ELISA

双抗夹心ELISA 法是指将特异性针对待测抗原的抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入待测抗原与固相载体上的抗体结合，而后加入生物素化的针对待测抗原的抗体，形成夹心。许兆君等建立了猪圆环病毒2型Cap 蛋白双抗体夹心ELISA 定量检测方法。试验采用氯化铯密度梯度超速离心方法制备PCV2 Cap 蛋白标准品，用纯化的Cap 蛋白免疫小鼠和家兔，分别获得特异性强的单克隆抗体和亲和力、敏感性较高的多克隆抗体，在此基础上建立了双夹心ELISA 定量检测PCV2 Cap蛋白的抗原检测方法。通过方阵试验确定捕获抗体兔多抗和酶标单抗最佳浓度都为1 ∶10 000，该方法建立的标准曲线线性相关系数大于0.99，定量检测上限为250 ng/mL，下限为15.6 ng/mL，在此范围内的检测结果可靠。

4.1.3 竞争性ELISA

竞争性ELISA 是将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成2 组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这2 组底物降解量之差，即可测定的未知抗原的量。Mu Y 等开发了一种以纳米体（Nb）-辣根过氧化物酶（HRP）融合蛋白为超敏探针的竞争性ELISA（cELISA），敏感性和特异性分别为99.68%和95.92%，该方法是一种快速可靠、低成本的基于纳米体的工具，可用于当前PCV2 疫苗疗效的血清学评估和PCV2 感染的间接诊断。

4.2 免疫层析试纸条

免疫层析是出现于20 世纪80 年代初期的一种新型的，快速的免疫分析方式。将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入待测样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动到固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原与该抗体发生特异性结合，用免疫胶体金染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。JIN Q 等成功开发出胶体金标记抗原探针的快速免疫层析试纸条，应用于PCV2 抗体的检测，通过条带和商用ELISA 试剂盒评估了500 个临床猪血清样品，免疫层析试纸条与ELISA 试剂盒的一致性为94.00%。该试纸可用作现场快速诊断PCV2 抗体的候选方法。

4.3 其他免疫学方法

单结构域抗体（sdAbs）和碱性磷酸酶（AP）的融合已被证明可用作免疫诊断试剂，psdAb-AP 融合效率高，需要更少的操作步骤，并且能在短时间内结束测定。Yang S等描述了一种与碱性磷酸酶（AP）融合的单结构域抗体（sdAbs）用于检测PCV2，为了评估psdAb-AP融合作为诊断试剂的实用性，将融合用于蛋白质印迹（WB）、直接ELISA 和免疫细胞化学测定（ICC）。结果表明，sdAbs 与AP 的融合为开发更优质的免疫试剂提供了有价值的途径，为PCV2 检测提供了一种简单，方便和灵敏的方法。

5 小结

PCV2 引起的猪圆环病毒病的发生对生猪生产有着重大影响，预防和控制该类疾病对于最大限度地减少经济损失至关重要。PCV2 的检测技术数不胜数，其中病毒分离鉴定方法因其耗时长，血清成本高等缺点不适于常规检测。电镜观察也因为电子显微镜设备价格较高，难以与同种属病毒区别等劣势同样不适于常规检测。目前，PCV2 在分子生物学方面的抗原检测方法研究较多，如PCR，LMAP，RPA，RAA，ISH 等；而免疫学检测方法研究较少，如ELISA，免疫层析等。许多研究人员对常用的抗原抗体检测方法以外的新型检测方法做了一些探索，发表了一些具备良好应用前景的PCV2 检测鉴定方法，但仍需继续发现更先进、更高效的临床检测技术，为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的PCV2 检测方法提供参考。