傅里叶红外光谱快速鉴定香蕉枯萎病方法的建立

王小虎 兰宝锋 韦圣博 何双 周礼芹

(广西科学院，广西 南宁 530007)

引言

香蕉(Musa nana Lour)是一种大型的草本植物，属芭蕉科芭蕉属，起源于东南亚和西太平洋，在国内主要分布于广西、广东、云南、海南以及台湾等地[1]。香蕉肉质鲜美，营养丰富，与苹果、柑橘以及葡萄并称世界4大水果，深受人们的喜爱。此外，在全球作物种植面积中，香蕉与小麦、玉米水稻以及水稻并称世界4大粮食作物[2]，香蕉产量位居第1，成为世界上第1大贸易水果[3]。

香蕉产业作为一种支柱性产业，在广西特色农业经济发展中起着至关重要的作用[4]，然而，随着香蕉产业的快速发展，其面临的挑战也日益艰巨，尤其是香蕉枯萎病的防治。香蕉枯萎病又称巴拿马病或香蕉黄叶病[5]，是由尖孢镰刀菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f.sp cubense race 4,Foc TR4)侵染香蕉的维管束组织导致组织坏死腐烂的一种毁灭性病害[6]。由于香蕉枯萎病是一种土传性病害，随着疾病的蔓延，其产量损失可高达100%，严重影响香蕉产业的发展。值得注意的是，自2006年于广西发现的首例香蕉枯萎病至今，香蕉枯萎病一直呈现蔓延的趋势，且在近几年呈指数型增长，导致香蕉的种植面积大幅度降低，甚至出现土地被迫荒废或改种其他农作物等情况[7]。因此，亟需一种安全、高效、经济的检测方法对香蕉枯萎病进行检测，从而尽快恢复香蕉产业的发展。

傅里叶红外光谱法(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR)是由分子基团振动而形成的振动吸收光谱[8]，常用于物质的定性与定量分析[9]。由于其具有操作简便、灵敏度高以及所需样品量少等特点，已被广泛运用于生物、食品和化学等领域。本研究主要利用傅里叶红外光谱法对健康的香蕉叶片以及患香蕉枯萎病的香蕉叶片进行检测分析，为准确、高效地鉴定香蕉枯萎病提供一种安全可靠的检测方法，也为其它病虫害的检测提供一种新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料为广西农业科学院试验田的巴西蕉叶片。

1.2 仪器设备和测试条件

实验仪器主要包括Thermo Scientific 公司Nicolet iS10型傅立叶变换红外光谱，Millipore超纯水仪器，SPS402电子天平，高速粉碎机，压片机，电热鼓风干燥箱。其中，傅立叶变换红外光谱仪光谱范围为4000～400cm-1，信号扫描累加次数32次[10]，光谱分辨率为4cm-1。

1.3 样品处理

取4株健康的香蕉叶片与4株患香蕉枯萎病的香蕉叶片分别进行烘箱干燥，取适量样品于高速粉碎机中粉碎，随后转入玛瑙钵中研磨，研磨均匀后进行压片，最后于傅里叶红外光谱仪中进行检测，样品各重复3次。

1.4 数据处理

利用OMNIC 9.0软件将采集的红外光谱信息进行吸光度、自动基线校准、平滑9.0和二阶导数处理，保存为TIF和CSV格式。将导出的CSV数据划分成900～1100cm-1、1100～1400cm-1以及2800～3000cm-13个波段，将其分别导入PAST 3.0软件进行PCA和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 健康与患病香蕉叶的红外光谱分析

2.1.1 健康香蕉叶红外光谱分析

由图1可知，4株健康香蕉叶的红外光谱图在波形上极其相似，其吸收峰的位置、数量以及大小也大致相同。值得注意的是，健康香蕉叶主要包含8个吸收峰，其波长依次为1031cm-1、1416cm-1、1462cm-1、1594cm-1、1734cm-1、2848cm-1、2916cm-1、3325cm-1。其中，在1031cm-1处形成一个强而宽的吸收峰，为多糖C-O-C的伸缩振动[11]；1416cm-1附近的吸收峰主要来自酚类物质中甲基的C-H的对称弯曲振动[12]；1462cm-1主要为-CH2-的伸缩振动[13]；1594cm-1附近形成一个较宽的吸收峰，主要为苯环上C=C骨架的伸缩振动[14]；1734cm-1附近形成1个尖锐的吸收峰，主要为苯环上C=O的伸缩振动[15]；2848cm-1和2916cm-1附近形成2个极其尖锐的吸收峰，为C-H的反对称伸缩振动吸收峰；3325cm-1附近形成的宽吸收峰为-OH的伸缩振动[16]。

图1 4株健康香蕉叶的红外光谱图

2.1.2 枯萎病香蕉叶的红外光谱分析

由图2可知，枯萎病香蕉叶的红外光谱图在波形上大致相似，但仍存在些许差异。枯萎病香蕉叶主要包含9个吸收峰，分别位于1030cm-1、1166cm-1、1317cm-1、1462cm-1、1612cm-1、1734cm-1、2847cm-1、2915cm-1、3214cm-1处。其中，在3214cm-1附近存在的宽而弱的吸收峰，为-OH的伸缩振动；2915cm-1和2847cm-1处形成的尖锐吸收峰为甲基和亚甲基的反对称伸缩振动与对称伸缩振动[17]；1734～1462cm-1的吸收峰主要为酰胺和羧基振动区，其中1612cm-1处的吸收峰为蛋白质酰胺Ⅰ带吸收[18]，同时还可能含有多糖的吸收[17]；1317cm-1处为C-H的剪切式振动；1030cm-1处形成的强吸收峰为多糖的C-O-C伸缩振动[11]。

2.2 健康香蕉叶与枯萎病香蕉叶的红外光谱比较

如图3所示，为健康香蕉叶与患枯萎病香蕉叶红外光谱的分层谱图，xjk代表患枯萎病香蕉叶的红外光谱图，xj代表健康香蕉叶的红外光谱图。由图可知，2种香蕉叶的红外光谱图波形相似，但在不同波长下的峰数、峰形与峰强度存在较为明显的差异，其具体差异如下：在1032cm-1附近，患病香蕉叶形成一个较强的吸收峰，而健康香蕉叶形成的吸收峰明显弱于患病香蕉叶；波长在1100～1500cm-1范围内，2种香蕉叶在吸收峰的数量以及强度方面存在明显的差异，健康香蕉叶在1416cm-1和1462cm-1处存在2个强度较弱的吸收峰，而患枯萎病香蕉叶则在1166cm-1、1317cm-1和1462cm-1处存在3个较弱的吸收峰；在1594cm-1以及1734cm-1附近，健康香蕉叶比患病香蕉叶的吸收峰更强；在2800～3000cm-1范围内，健康香蕉叶于2916cm-1和2848cm-1处存在2个最强尖峰，而患枯萎病香蕉叶的吸收峰明显变弱。综上所述，健康香蕉叶的吸收峰明显强于患枯萎病香蕉叶，故健康香蕉叶的物质成分如糖类、脂质、蛋白质以及碳水化合物等在含量上均高于患枯萎病香蕉叶。

图2 4株患病香蕉叶的红外光谱图

图3 健康香蕉叶与患病香蕉叶的红外光谱图

2.3 健康香蕉叶与患枯萎病香蕉叶的二阶导数分析

二阶导数红外光谱可将一些微小的差异放大或将重叠峰展开[19]，故对健康香蕉叶与患枯萎病香蕉叶进行二阶导数分析将有利于将2种不同的香蕉叶进行区分。如图4所示，为健康香蕉叶与患病香蕉叶的二阶导数图。由图4可知，2种香蕉叶在二阶导数方面存在显著差异，在1400～1800cm-1和2800～3000cm-1范围内，健康香蕉叶的二阶导数明显强于患病香蕉叶。由于2800～3000cm-1附近主要是蛋白质与多糖的振动吸收峰，故健康香蕉叶的蛋白质与多糖含量更高，因此，利用二阶导数红外光谱法可以鉴别健康香蕉叶与患病香蕉叶。

图4 健康香蕉叶与患病香蕉叶的二阶导数图

2.4 健康香蕉叶与患枯萎病香蕉叶的主成分分析

对健康香蕉叶与患枯萎病香蕉叶选择900～1100cm-1、1100～1400cm-1、2800～3000cm-1范围进行主成分1和主成分7分析，其结果如图5所示，1为正常香蕉叶，2为患病香蕉叶，主成分1为横坐标，贡献率为99.28%，主成分7为纵坐标，贡献率为0.29%，累计贡献率为99.57%，说明以主成分1和主成分7为代表进行主成分分析是真实可靠的。由图5可知，健康香蕉叶与患病香蕉叶分别聚合在2个不同的区域，并且两者之间无交叉，说明利用主成分1和主成分7 2种成分能明显地区分健康香蕉叶与患枯萎病香蕉叶。

图5 4株健康香蕉叶与4株患枯萎病香蕉叶PCA分析

2.5 健康香蕉叶与患病香蕉叶的聚类分析

图6为健康香蕉叶与患枯萎病香蕉叶在900～1100cm-1、1100～1400cm-1、2800～3000cm-1范围内的二阶导数聚类分析图。由图6可知，健康香蕉叶分为2类聚类，分别为xj1和xj4，xj3和xj2；患病香蕉叶分为3类聚类，分别为xjk2和xjk4，xj1与xjk2、xjk4聚为1类，xjk3与xj1、xjk2、xjk4聚为1类。4株健康香蕉叶和4株患病香蕉叶各聚为一大类，说明利用该聚类方法可有效区分健康香蕉叶与患枯萎病香蕉叶。

图6 4株健康香蕉叶与4株患枯萎病香蕉叶的二阶

3 讨论

由傅里叶红外光谱图可知，2种不同的香蕉叶片在波形上极其相似，但在吸收峰的位置、强度以及大小方面存在显著差异。在本研究中，4株健康香蕉叶的红外光谱图基本完全一致，4株患病香蕉叶中有一株香蕉枯萎病叶的图谱与其他3株叶片的图谱略有差异，可能是由其患病程度的不同而导致。此外，经过原始数据光谱分析以及二阶导数图谱分析，健康香蕉叶具有更强的吸收峰强度，从而表明健康香蕉叶的物质成分如蛋白质、脂质、多糖等在含量上均高于患病香蕉叶。将900～1100cm-1、1100～1400cm-1和2800～3000cm-13个具有显著差异的波段进行PCA分析与聚类分析，可以清楚地区分出健康香蕉叶与患病香蕉叶。综上所述，利用傅里叶红外光谱分析技术，结合PCA分析以及聚类分析可以快速、准确、高效地区分出健康香蕉叶与患病香蕉叶，为准确、高效地鉴定香蕉枯萎病提供一种安全可靠的检测方法，也为其它病虫害的检测提供一种新的研究思路。

4 结论

傅里叶光谱显示健康香蕉叶的吸收峰明显强于患病香蕉叶，因此健康香蕉叶的物质成分如糖类、脂质、蛋白质以及碳水化合物等在含量上均高于患病香蕉叶。

通过对900～1100cm-1、1100～1400cm-1和2800～3000cm-13个具有显著差异二阶导数的波段进行PCA分析与聚类分析，可以快速清楚地区分出健康香蕉叶与患枯萎病病香蕉叶。