木犀草素对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡及自噬的影响

杨 朋， 钱 军， 陈文飞， 邓怀冬

(攀枝花学院附属医院药剂科，四川 攀枝花 617000)

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，因其发病率、复发率、死亡率高的特点，对人类健康造成巨大威胁[1-2]。非小细胞肺癌占全部肺癌患者的75%～85%，其侵袭能力强、预后差[3]。由于肺癌的发病机制复杂且尚未阐明，目前尚无治愈肺癌的根本方法[4]。目前，手术治疗、放疗和化疗仍为临床上治疗肺癌的主要手段，手术治疗虽在一定程度上能缓解疾病进程，但复发率较高；放疗因存在较大的副作用，应用受到限制；化疗在一定程度上改善患者症状和生活质量，但存在广泛的耐药性[4-5]。因此，寻找安全、有效的新型肺癌治疗药物意义重大。

木犀草素是一种天然黄酮化合物，广泛存在于芹菜、西兰花、苹果等蔬菜和水果中，具有多种生理活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤和神经保护等[6-8]。本研究以人非小细胞肺癌A549细胞为对象，探讨木犀草素对其活力、凋亡和自噬的影响，为木犀草素的进一步研究开发奠定基础。

1 材料

1.1 细胞 人非小细胞肺癌A549细胞购于中国科学院昆明细胞库。

1.2 试剂与药物 木犀草素(纯度98%，批号L107328)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；青链霉素溶液、Hoechst 33258染液购于上海碧云天生物技术有限公司；10×RIPA裂解液、cleaved-caspase-9(货号9505)、caspase-9(货号9502)、cleaved-caspase-3(货号9664)、caspase-3(货号9662)、Bax(货号2772)、Bcl-2(货号3498)、LC-3(货号4108)、p-PI3K(货号4228)、PI3K(货号4255)、p-Akt(货号4060)、Akt(货号2920)、p-mTOR(货号5536)、mTOR(货号2972)、β-actin(货号3700)抗体、HRP标记二抗兔(货号7074)购于美国Cell Signaling Technology公司；pEGFP-LC3质粒(PPL00363-2a)购于质粒与蛋白共享库；ExFect2000转染试剂购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养 A549细胞于含10% FBS、1%青链霉素溶液的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每天更换培养液。细胞融合度达70%～80%时传代或用于实验。

2.2 MTT法检测细胞活力 取对数生长期的A549细胞以每孔5×103个的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后以200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L木犀草素分别干预A549细胞12、24、36 h，弃上清液，向各孔加入含0.5 mg/mL MTT的培养液，置于培养箱中继续培养3 h，然后轻轻吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上室温振摇5 min，于570 nm波长处测定各孔吸光度，并以对照组平均值为基准计算各组相对细胞活力。

2.3 细胞分组及给药 取对数生长期的A549细胞以每孔2×105个的密度接种于6孔板，分为对照组和木犀草素低、中、高剂量组(12.5、25、50 μmol/L)，待细胞贴壁后开始干预，各组同时干预24 h。

2.4 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡 细胞按“2.3”项下方法分组及给药，干预结束后弃培养液，用PBS润洗2次，每孔加1 mL预冷的4%多聚甲醛，于4 ℃固定20 min，然后弃多聚甲醛，PBS润洗2次，每孔加1 mL Hoechst 33258染液，室温染色5 min，PBS润洗细胞，于倒置荧光显微镜拍照。

2.5 Western blot检测蛋白表达 细胞按“2.3”项下方法分组及给药，干预结束后弃培养液，PBS润洗细胞，每孔加100 μL 1×RIPA裂解液，置于冰上裂解20 min，收集细胞，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液即得总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，加入5×Loading buffer混匀，95 ℃加热5 min后，涡旋混匀后上样。经电泳、转膜后，用10%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，次日弃一抗，加入二抗室温孵育1 h，然后用ECL发光液显影。

2.6 转染pEGFP-LC3质粒并观察木犀草素对A549细胞自噬斑点形成的影响 细胞按“2.3”项下方法分组，待细胞贴壁后，按说明书方法向A549细胞转染pEGFP-LC3质粒，每孔2 μg，转染16 h后，按“2.3”项下方法给药，干预结束后，弃培养液，PBS润洗细胞，每孔加1 mL预冷的4%多聚甲醛，于4 ℃固定20 min，弃多聚甲醛后用PBS润洗，于倒置荧光显微镜拍照。

3 结果

3.1 木犀草素抑制A549细胞活力 A549细胞经不同浓度木犀草素分别干预12、24、36 h后，细胞活力呈剂量和时间依赖性降低(P<0.01)，24、36 h的IC50分别为29.88、22.41 μmol/L，见图1。

注：与对照组比较，**P<0.01。

3.2 木犀草素诱导A549细胞凋亡 Hoechst 33258染色后，活细胞核呈弥散均匀荧光，荧光强度较弱；细胞凋亡后细胞核和胞质呈浓染致密的斑块，荧光强度增强。如图2所示，木犀草素可剂量依赖性地增加A549细胞Hoechst 33258染色荧光强度(P<0.05，P<0.01)，表明木犀草素可诱导A549细胞凋亡。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 木犀草素促进凋亡相关蛋白表达 caspase-9和caspase-3的在细胞凋亡进程中具有重要作用，其活化后可启动细胞凋亡。如图3所示，木犀草素剂量依赖性地促进caspase-9和caspase-3的裂解和活化(P<0.01)，促进Bax表达和抑制Bcl-2表达(P<0.01)。

注：与对照组比较，**P<0.01。

3.4 木犀草素提高A549细胞自噬标志蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值 自噬是细胞一种重要的程序性死亡方式，有研究表明激活自噬可能是抑制肿瘤的有效途径。自噬标志蛋白LC-3是反应细胞自噬活性的经典标志物，木犀草素可剂量依赖性地提高LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值(P<0.01)，表明木犀草素可激活A549细胞自噬，见图4。

注：与对照组比较，**P<0.01。

3.5 木犀草素促进A549细胞自噬斑点形成 如图5所示，木犀草素可剂量依赖性地促进A549细胞自噬斑点的形成(P<0.01)，进一步说明了木犀草素对自噬的激活作用。

3.6 木犀草素抑制A549细胞PI3K/Akt/mTOR通路 如图6所示，木犀草素抑制p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达(P<0.05，P<0.01)，提示PI3K/Akt/mTOR通路被抑制，说明木犀草素激活自噬可能与抑制PI3K/Akt/mTOR通路有关。

4 讨论

细胞的死亡方式通常有2种，即细胞坏死和程序性死亡，而凋亡和自噬性死亡是2类最为重要的细胞程序性死亡，对于清除体内异常细胞维持机体健康至关重要[9-11]。目前有大量研究表明，凋亡和自噬是抑制肿瘤进程的重要途径[12-13]。木犀草素具有显著的抗氧化、抗炎和神经保护作用，亦有研究表明木犀草素可抑制食管癌、卵巢癌和肺癌细胞的增殖和迁移[14-15]，但关于木犀草素对肺癌细胞的凋亡和自噬的研究较少，且相关的分子机制尚不清楚。本实验以最常用的人非小细胞肺癌A549细胞为对象，首先研究了木犀草素对A549细胞活力的影响，结果显示，木犀草素能够抑制A549细胞活力，Hoechst 33258染色结果亦表明木犀草素能够促进A549细胞凋亡，说明木犀草素对A549细胞具有良好的抑制作用，这与之前的研究结果一致[7,16]。

凋亡是一个复杂的调控过程，涉及到包括Bcl-2以及Bcl-2家族成员Bad和Bax在内的许多基因和蛋白[11]。诱导细胞凋亡有2种途径，一种是由细胞间信号激活的内在途径，也称为线粒体途径；另一种是由细胞外信号激活的外在途径，也称为死亡受体途径，而caspase蛋白酶家族是上述2种凋亡途径的关键因子。本研究结果显示，木犀草素可促进Bax表达，抑制Bcl-2蛋白表达，从而提升了Bax/Bcl-2比值，降低了凋亡发生的阈值，随后促进caspase-9裂解形成活化态的cleaved-caspase-9，进一步促进了caspase-3的裂解和活化并激活其下游底物如PARP，最终导致细胞凋亡的发生。

注：与对照组比较，**P<0.01。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

自噬与肿瘤发生、细胞发育和死亡密切相关，可降解受损细胞器和错误折叠蛋白质，为细胞代谢提供物质来源和能量，而过度自噬则导致细胞死亡，即自噬性死亡[17-18]。本研究结果表明，木犀草素可促进LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ转化，同时促进自噬斑点的形成，说明木犀草素可促进A549细胞自噬。在调节自噬活性的众多信号通路中，PI3K/Akt/mTOR被认为具有关键作用[19]。PI3K/Akt/mTOR是一种促生存信号，调控细胞增殖、分化和迁移等功能，在癌细胞中常被激活，从而延缓肿瘤细胞凋亡，促进增殖、血管生成、侵袭和转移[10]。因此，抑制PI3K/Akt/mTOR通路可能导致肿瘤细胞自噬性死亡。本研究发现，木犀草素可降低PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平从而抑制PI3K/Akt/mTOR通路，说明木犀草素促进自噬可能与抑制PI3K/Akt/mTOR通路有关。

综上所述，木犀草素可能通过凋亡和自噬2条途径促进A549细胞死亡，进一步阐明了木犀草素对非小细胞肺癌A549细胞的抑制效果，为木犀草素进一步开发成为新型抗非小细胞肺癌药物奠定了基础。