miR-17-5p 在尼罗罗非鱼性腺中的表达及其对雌激素的应答反应特征

安丽霞，吴小叶，王伟伟

（1.晋中信息学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学动物科学学院，山西 太谷 030801；3.朔州市平鲁区畜牧兽医中心，山西 朔州 036000）

MiRNA-17-5p 是miRNA-l7-19 家族的成员，广泛分布在动物多种组织中[1]。至今miRBase（22.0）数据库中已注释了37 个物种的miR-17-5p 序列，在脊椎动物中进化保守[2]，参与细胞分化[3]、调节生长[4]、与肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程相关[5]。研究表明，miR-17-5p 在动物繁殖相关的过程中发挥着重要的作用。其中，miR-17-5p 对鼠黄体血管的形成必不可少[6]，而其在绵羊胎儿性腺和幼鼠的性腺中也具有高表达[7，8]。在斑马鱼（Barchydanio rerio var.）卵巢滤泡细胞中，miR-17-5p 在卵黄形成早期的表达量高于晚期[9]。miR-17-5p 作为抑制癌细胞的小RNA，其表达与雌激素水平相关，在人乳腺癌细胞（MCF-7）细胞系中，雌激素能改变其表达量[5]。目前，有关尼罗罗非鱼性腺中miR-17-5p 的表达以及鱼类性腺中miR-17-5p 对雌激素应答反应特征等尚未见相关研究。本研究采用荧光定量PCR 的方法检测了miR-17-5p 在尼罗罗非鱼性腺中及雌二醇（E2）处理后性腺中的表达特征，并采用生物信息软件预测了miR-17-5p 的靶基因，对靶基因进行了生物信息学分析，为进一步研究miR-17-5p 在尼罗罗非鱼性别控制的潜在调控功能提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

1.1.1 miR-17-5p 在尼罗罗非鱼性腺中的表达

60 日龄的尼罗罗非鱼雌、雄鱼各6 尾，麻醉后解剖取其精巢和卵巢，放于液氮中速冻，随后-80℃保存，用于提取总RNA。

1.1.2 雌二醇对miR-17-5p 在尼罗罗非鱼性腺中表达的影响

取雌雄的尼罗罗非鱼幼鱼各50 尾，平均体质量为（43.1±0.2）g，平均体长为（11.2±0.1）cm，分为4 组：雌二醇处理雄鱼组、对照雄鱼组、雌二醇处理雌鱼组和对照雌鱼组，每组25 尾。雌二醇先用无水乙醇溶解后，再用芝麻油按照体积比1∶10 稀释，胸鳍基部腹腔注射，浓度为10 mg/kg 体质量。对照组注射无水乙醇与芝麻油（体积比1∶10）的混合液。注射2 d、7 d、14 d、21 d 和28 d 时，取实验鱼精巢和卵巢组织（每次每组各取4 尾鱼），置于液氮中速冻后，于-80℃低温冰箱中保存备用。

1.2 总RNA 的提取

根据文献[10]提取精巢和卵巢总RNA，测定RNA的浓度和完整性。

1.3 引物设计与合成

根据测序获得的尼罗罗非鱼miR-17-5p 序列设计特异性引物：5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTA-3'，引物由上海生工合成，下游引物为TAKARA试剂盒自带的通用引物。

1.4 反转录和荧光定量

利用SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR 试剂盒（TaKaRa，RR716）对总RNA 中的miRNA 及其他小RNA 进行Poly（A）加尾反应，然后利用Universal Adaptor Primer 进行反转录得到cDNA，最后进行荧光定量，具体方法见参考文献[10]。利用2-ΔΔCT计算miR-17-5p 的相对表达量，利用SPSS 软件分析表达差异。

1.5 miR-17-5p 靶基因预测及其靶基因的生物信息学分析

由于罗非鱼的相关信息没有在miRNA 靶基因预测软件数据库中收录，所以miR-17-5p 的靶基因预测以斑马鱼基因组为基础进行。利用DIANA TOOLS 软件（http://diana.imis.Athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/index）和TargetScan 软件（http://www.Targetscan.org/fish_62/）分别进行靶基因预测，然后利用Venny 软件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取2 种算法预测的靶基因的交集，并利用上海伯豪生物技术有限公司的富集软件（http://enrich.shbio.com/index/ga.asp）对交集靶基因进行Gene ontology 富集分析和KEGG pathway分析。

2 结果与分析

2.1 尼罗罗非鱼性腺中miR-17-5p 表达差异

miR-17-5p 在尼罗罗非鱼精巢和卵巢组织中均有表达，在卵巢中的表达量为精巢的10 余倍，极显著高于精巢（P＜0.01）（图1）。

图1 miR-17-5p 在尼罗罗非鱼精巢和卵巢中的表达差异Fig.1 Expression difference of miR-17-5p in testis and ovaries of Nile tilapia

2.2 尼罗罗非鱼幼鱼经17α-乙炔雌二醇处理后，性腺中miR-17-5p 的表达变化

17α-乙炔雌二醇处理尼罗罗非鱼幼鱼后，性腺中miR-17-5p 的表达量变化显著。与对照组相比，E2 处理后2d、7d、14d 和21d，卵巢中miR-17-5p的表达量显著降低（P＜0.05），28 d 后，其表达量呈上升趋势，但差异不显著（P＞0.05）。17α-乙炔雌二醇处理2 d 和7 d 后，精巢中miR-17-5p 的表达量分别极显著和显著降低，至14 d 时表达量回升高。注射E2 后，性腺中miR-17-5p 表达趋势仍为精巢的表达量显著低于卵巢（P＜0.01）（图2）。

图2 17α-乙炔雌二醇处理尼罗罗非鱼后精巢和卵巢中miR-17-5p 表达量的变化Fig.2 Change in expression level of miR-17-5p in testis and ovaries of Nile tilapia exposed to 17α-ethinyl estradiol

2.3 通过软件预测miR-17-5p 的靶基因

通过DIANA TOOLS 和TargetScan 软件分别预测出miR-17-5p 的潜在靶基因分别为526 和6 612个，其交集靶基因为333 个（图3）。

图3 Diana 与Targetscan 预测的miR-17-5p 靶基因的交集数Fig.3 The intersection of miR-17-5p target genes predicted by Diana and Targetscan

2.4 交集靶基因的功能分析

利用伯豪公司的富集软件对333 个交集靶基因的Gene ontology 分析和KEGG 通路分析见图4。Gene ontology 分析结果显示，333 个靶基因中有238个基因分别富集到了214 个生物学过程条目（Biological process）、72 个分子生物学功能条目（Molecular function）和31 个细胞组分条目（Cellular component）。显著富集的前30 个GO 条目（图4），主要包括生长、发育、代谢和蛋白质修饰等相关过程，其中与繁殖相关的FZD3B、CAPRIN2、WNT8B、WNT9B和SMO 富集到了经典WNT 信号通路（canonical Wnt signaling pathway）。除这5 个基因外，MYLIPA富集到了WNT 信号通路（Wnt signaling pathway）。

图4 交集靶基因GO 富集分析Fig.4 GO analysis of intersection target genes

KEGG 通路分析结果显示，333 个交集靶基因中83 个基因富集到72 个KEGG 通路，显著富集的前30 个KEGG 通路见图5。与繁殖相关的通路有MAPK 信号通路（包括的靶基因有：GNG12A、TAOK3B、MAP3K3、TAOK3A、FGF4 和CHUK）、TGFbeta 信号通路（包括的靶基因有：AMH 和SMAD1）、WNT 信号通路（包括的靶基因有：FZD3B、WNT8B、PLCB3 和WNT9B）和孕酮调节的卵母细胞成熟通路（包括的靶基因有：PDE3B 和SPDYA）。SPDYA 和PLCB3 分别富集到了卵母细胞减数分裂通路和GnRH 信号通路中。

图5 交集靶基因KEGG 通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis of intersection target genes

3 讨论

有研究表明，miR-17-5p 是在多种组织广泛表达的短链非编码RNA，参与生长、细胞的分化和肿瘤细胞的增值、凋亡等[3-5]。MiR-17-5p 在妊娠42 d的绵羊胚胎雌雄性腺中高表达，而妊娠72 d 则表达较低[7]。MiR-17-5p 在幼鼠发育的卵母细胞的卵子发生期高表达[8]、原生殖细胞和精原细胞中均高表达[11]。斑马鱼（Barchydanio rerio var.）卵巢滤泡细胞中，miR-17-5p 表达量在卵黄形成的早期高于晚期，且用人绒毛膜促性腺激素（LH）处理后，滤泡细胞中miR-17-5p 的表达显著降低，但不影响其在卵母细胞中的表达[9]。而与无卵黄期的肝脏相比，斑马鱼的有卵黄期肝脏miR-17-5p 表达水平高[12]。这些研究说明miR-17-5p 在动物繁殖中发挥重要作用。miRNA-17-92 家族的miRNA 在鼠的卵子发生过程中是细胞增殖的促进剂和细胞凋亡的抑制剂[8]。本研究中，60 日龄的尼罗罗非鱼处于精子和卵子发育的关键时期，miR-17-5p 在精巢和卵巢中均有表达，且在卵巢中的表达量显著高于精巢，说明miR-17-5p 参与鱼类幼鱼的性腺发育。

雌激素是一种类固醇激素，参与多种细胞和生理过程以及癌症等疾病的发展，在鱼类的性别决定和性腺发育中发挥重要作用。已有研究证实，miRNA 参与雌激素信号通路和代谢，也可调节miRNA的表达[13]。雌激素可直接调节miRNA 的转录，也可通过调节miRNA 生物合成通路上的关键酶和元件，调控miRNA 的产生和发挥功能[12]。在疾病研究中，乳腺癌的诱因之一就是扰乱的雌激素信号。雌激素处理人乳腺癌细胞系（MCF-7），会引起一系列miRNA 表达降低[14]。miR-17-5p 作为抑制癌细胞的小RNA，在该细胞系中，雌激素（E2）能使其表达降低[5]。雌激素暴露后，斑马鱼肝脏中的miRNA 表达量会降低[12]，但是，miR-17-5p 的表达未发生显著变化。本研究中，尼罗罗非鱼幼鱼腹腔注射雌二醇后，精巢和卵巢中的miR-17-5p 表达量均显著降低后又升高，这说明在尼罗罗非鱼幼鱼的性腺中雌激素能够显著降低miR-17-5p 的表达，调控性腺发育。

miRNA 的功能是转录后水平微调靶基因的表达。靶基因预测是研究miRNA 功能的重要手段。本研究采用不同的方法对miR-17-5p 的靶基因进行预测，并对靶基因取交集，进行GO 分析发现，多个基因富集于WNT 信号通路。研究表明，WNT 信号通路可促进绵羊卵泡的发育，其表达与雌激素浓度呈正相关[15]。雌二醇可以调控WNT 信号通路基因的表达[16]。WNT9B 基因对哺乳动物生殖系统具有重要作用，完全敲除WNT9B 基因后，雌小鼠输卵管和子宫缺失，雄鼠附睾和输精管缺失，但卵巢和精巢组织正常[17]。对miR-17-5p 交集靶基因的KEGG分析发现，与繁殖相关的除了WNT 信号通路外，还包括MAPK、TGF-beta、卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂和GnRH 等信号通路。MAPK 信号通路参与调节精子的发生、成熟、凋亡，及精子获能和顶体反应等繁殖过程[18]，其中FGF4 基因可诱导精子发生[19]。TGF-beta 信号通路在哺乳动物的卵泡发生和排卵过程以及配子形成过程中发挥重要作用。AMH（抗苗勒管激素）在雌性青春期之前都不表达[20]，性成熟后，卵巢的颗粒细胞进行有丝分裂，AMH 会高表达[21]。AMH 在雄性青春期前睾丸组织高表达，与支持细胞的有丝分裂活性相关，参与精子发生[22]。SMAD1 对精子发生、发育和成熟起重要调节作用[23]。卵母细胞减数分裂和成熟通路以及GnRH 信号通路都与性腺发育密切相关。SPDYA 基因能促进非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵的细胞周期G2 期到M 期的转换[24]。miR-17-5p 靶基因的预测和功能分析有助于进一步分析miR-17-5p 在鱼类性腺发育中的作用。雌二醇也会影响这些靶基因所在的信号通路[16]，它们彼此间的具体调控网络有待于进一步的研究。

结论

本研究发现，miR-17-5p 在尼罗罗非鱼幼鱼的精巢和卵巢中均表达，在卵巢中显著高表达，说明miR-17-5p 参与尼罗罗非鱼幼鱼的性腺发育。用雌二醇处理后，精巢和卵巢中miR-17-5p 表达量显著降低，说明雌二醇可以抑制该miRNA 的表达。多种软件预测出的靶基因取交集后，多个靶基因富集与性腺发育以及繁殖相关的通路，为分析miR-17-5p的靶标关系奠定基础，为进一步研究其在鱼类性别分化和控制中的作用提供理论依据。