多重耐药铜绿假单胞菌RND外排泵基因调控研究进展

刘莹 费冰 任彦颖 郭梦雨 刘心伟 刘冬梅 李永伟

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种革兰氏阴性非发酵菌，在自然界中广泛存在并能耐受恶劣环境，可引起各种医院获得性感染，包括肺炎、血流感染和囊性纤维化患者的感染，同时也是囊性纤维化患者的主要致死原因。目前，多重耐药铜绿假单胞菌感染增加，给临床治疗带来困难，所以迫切需要新的抗生素进行防治。铜绿假单胞菌的耐药机制十分复杂，其中外排泵的过度表达促使抗生素从细胞内排出是导致抗生素抗菌活性降低的重要原因。铜绿假单胞菌主要产生抗药小结分裂区（Resistance nodulation division，RND）家族和主要促进剂超家族（Major facilitator super，MFS）两种外排泵，两者都使用质子梯度排出底物。其中RND家族的MexAB-OprM、MexXY-OprM、MexCDOprJ和MexEF-OprN外排泵被认为是获得性多重耐药的主要原因[1]。现就国内外多重耐药铜绿假单胞菌RND外排泵的研究进展进行总结，为铜绿假单胞菌的治疗提供新思路。

1 RND外排泵的结构及耐药特点

RND家族外排泵通常存在于革兰氏阴性菌中，几乎全部由染色体编码，由其特有的内膜泵蛋白（如MexB）、外膜因子家族的外膜蛋白（如OprM）和膜融合蛋白家族的周质辅助蛋白（如MexA）3种成分组成[2]。周质辅助蛋白将内膜蛋白和外膜蛋白结合在一起，形成将底物排出的通道[1，3]。既往研究发现，铜绿假单胞菌中至少存在12种RND外排泵，在这些已知的RND泵中，MexAB-OprM、MexXYOprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN在临床上最重要，其中MexAB-OprM和MexXY-OprM外排泵更常见，在临床分离株中均存在过表达，尤其是在囊性纤维化患者和碳青霉烯类耐药患者中[4]。此外，这几类外排泵都可能对抗生素产生可诱导的、不可遗传的耐药性[5]。

RND类外排泵功能十分强大，能够泵出包括抗生素和外源生物物质在内的多种物质，其导致的耐药特点包括广泛性耐药、可诱导性耐药和低水平性耐药。广泛性耐药是指在包括铜绿假单胞菌在内的所有革兰氏阴性细菌中，外排泵通过改变外膜（Outer membrane，OM）通透性并主动将抗菌药物排出体外的一种防御机制。由于主动外排泵和OM之间的协同作用，革兰氏阴性菌细胞膜可以非常有效地保护细菌免受抗生素的作用，同时使抗生素缓慢渗透到OM中，从而引起抗生素的有效外流。因此，主动外排泵和OM屏障的联合作用可以保护细胞免受多种化合物的伤害。可诱导性耐药是指外排泵机制在参与天然耐药的同时，也可通过获得性的诱导使外排泵表达上调从而促进主动外排，已有研究通过体外药物诱导实验证实PA可在低剂量、长时间抗生素作用后刺激外排泵表达上调而产生高水平耐药[6]。低水平性耐药是指相对于水解酶产生、靶点突变或者生物膜形成所需的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）的升高而言，外排泵对于细菌MIC的升高是低水平的。

新型抗生素开发面临的主要挑战是通过改变抗生素的结构以增加其在革兰氏阴性菌胞内的积累量，增大抗菌效率。因此，可以通过设计避免外排机制发挥作用的分子，或者使用外排泵抑制剂（Efflux pump inhibitor，EPI）抑制主动外排来减少抗生素通过OM的泵出，从而提高抗生素的作用效率[7]。

2 RND外排泵的调节机制

铜绿假单胞菌耐药机制复杂，外排泵的表达也受多种因素影响，如群体感应系统、底物活性变化以及外排泵基因的过表达或突变，均可引起外排泵的过表达或者被抑制。4种临床常见高表达外排泵中，MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexXY-OprM属于负调节表达，分别受负调控蛋白MexR、NfxB和MexZ的调控，编码基因位于相应外排泵编码区上游，均与外排泵转录方向相反。MexEF-OprN属于正调节表达，受正调节蛋白MexT的调控，编码基因亦位于外排泵上游，但与之转录方向一致。MexXY利用MexAB系统的外膜蛋白OprM，故MexAB-OprM表达下调影响MexXY系统的表达水平，而MexABOprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN之间表达存在逆向关系，表明RND外排系统的调控机制和调控网络极其严谨精密，各成员之间存在着极为复杂的相互关联和作用[2]。

3 外排泵MexAB-OprM

3.1 外排泵 MexAB-OprM的作用机制 MexAB-OprM系统是RND家族药物外排泵中发现最早、作用底物最广泛的外排泵，其外排功能主要包括释放抗生素以及一系列两亲分子、消毒剂、染料、溶剂或洗涤剂等外源性有毒化合物。MexAB-OprM系统在铜绿假单胞菌的获得性耐药中起主导作用，对多种抗生素如β-内酰胺类、β-内酰胺类抑制剂、氟喹诺酮类、四环素类、替加环素类、新霉素类、巯基内酰胺类、磺胺类、大环内酯类、氨基糖苷类等均具有外排作用[3，4]。有研究显示，MexAB-OprM对氧氟沙星的外排是其导致铜绿假单胞菌多重耐药的主要因素。同时，MexAB-OprM编码基因呈组合性表达与铜绿假单胞菌的固有耐药也密切相关。药物试验证实MexAB-OprM的失活可使野生株PA对多种抗菌药物高度敏感，证明了此系统在铜绿假单胞菌固有耐药中的重要作用[5]。此外，研究表明，MexAB-OprM泵还作用于群体感应系统（Quorumsensing system，QS系统），细菌利用QS在高细胞密度下通过产生称为自身诱导物的信号分子来协调群体行为。铜绿假单胞菌有3个主要的相互连接的QS系统，即顶部的LAS系统、紧随其后的RHLIR系统和假单胞菌喹诺酮信号分子（Pseudomonas quinolone signal，PQS）[6，7]。RHL系统产生的N-丁酰高丝氨酸内酯（C4-HSL）信号自由扩散到细胞外，而LAS和PQS分别产生的3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯（3-O-C12-HSL）和PQS信号需要由膜转运体穿过外膜输出[8，9]。外排泵MexAB-OprM主要作用机制是运输LAS系统产生的QS前体信号分子3-O-C12-HSL，与3-O-C12-HSL的外流有关。更多的数据表明，外排泵MexAB-OprM也能外排参与细菌群体感应的非渗透性自体诱导剂，其在内源性金属载体分泌中的额外功能提示外排泵MexAB-OprM可能间接参与重要小分子天然化合物的分泌[10]。

3.2 外排泵MexAB-OprM的基因调控机制 外排泵MexAB-OprM调控网络涉及多个转录调控因子和调节因子，包括正向调控因子MexA、CpxR和ArmR和负向调控因子MexR、AmpR、NalC、NalD、MexT和MdrR1等[11]。MexA是MexAB-OprM外排泵的周质辅助蛋白，MexA上调可以引起MexAB-OprM过表达，从而导致多药耐药[12]。MexR是一种由MexR基因编码的局部抑制因子，位于MexAB-OprM操纵子的上游，MexR[13]突变通常与MexAB-OprM过表达相关。研究表明，MexR中由R70Q替换引起的MexAB-oprM的高表达是导致铜绿假单胞菌对氨曲南产生耐药的重要因素[14]。NalC由PA3721基因编码[15]，是TetR家族的抑制因子，负调控位于NalC下游的PA3720-PA3719操纵子。其中PA3719编码一个仅包含53个氨基酸残基调节因子为AmrR因子，其作为一种抗抑制因子与MexR相互作用，以变构抑制MexR控制的基因表达。AmrR的失活可将MexAB-OprM的表达降低到野生型水平，从而使多重耐药性铜绿假单胞菌恢复敏感性。同时，NalD调控因子的氨基酸突变也可导致MexAB-OprM药物外排泵的过度表达[16]。此外，研究表明，双组分调节系统RocS2-RocA2也可以通过RocA2响应调节器抑制MexAB-OprM的表达。

4 外排泵MexXY-OprM

4.1 外排泵MexXY-OprM的作用机制 外排泵MexXY-OprM最主要的功能是通过主动外排胞内药物而介导铜绿假单胞菌的天然和获得性耐药，可以外排氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、氯霉素、替加环素和两性离子型头孢菌素等抗菌药物，从而诱导铜绿假单胞菌的耐药。该外排泵具有底物特异性，其中氨基糖苷类是MexXY专一的特异底物。外排泵MexXY-OprM在铜绿假单胞菌野生型耐药性表型中的作用仅限于针对核糖体的泵底物，例如核糖体靶位药物四环素、庆大霉素、红霉素等。与此同时在MexY周质连接槽（Periplasm-linked cleft）也有其识别区，因此MexXY还可作为MexAB-OprM的补偿机制协同外排氟喹诺酮类药物，导致该类药物耐药水平升高。同时高氧环境亦可诱导MexXY表达上调，囊性纤维化患者分离菌株稳定高表达MexXY，可能是细菌在局部活性氧富集环境下的应激反应。相关文献报道MexXY-OprM也与PmrB突变体中的氨基糖苷类抗药性有关，并通过ArmZ的抗阻遏蛋白的复杂转录衰减机制间接触发操纵子MexXY的表达。编码MexXY的TetR局部抑制子的基因MexZ的功能丧失突变是铜绿假单胞菌临床菌株对氨基糖苷类药物敏感性降低的常见原因。

4.2 外排泵MexXY-OprM的基因调控机制 MexXYOprM外排泵在标准实验室条件下可被核糖体靶向制剂诱导并产生耐药性。氨基糖苷类修饰酶（AMES）的获得是耐药的主要驱动因素。然而，AME的获得与MexY的过度表达密切相关[17]。MexXY-OprM是被描述为唯一外排氨基糖苷类药物的泵。MexY是MexXY-OprM外排泵底物特异性的决定成分。在AME和氨基糖苷类存在的情况下，由于MexXY驱动的外排活性增加，导致细胞内质子水平增加，进而影响耐药性[17]。MexZ是MexY的负调控因子。MexXY操纵子被MexZ抑制，MexZ基因的产物与位于MexZ-MexX间隔区的反向重复区域结合，MexZ与MexZ-MexX基因间位点特异性结合，因此MexZ突变体可表现出组合性过表达MexXY-OprM[18]。同时MexXY可以对大环内酯抗生素或肽脱甲化酰酶抑制剂进行诱导。因此产生的异常多肽及其氧化修饰产物与PA5471相互作用，以此来调节MexXY。PA5471基因的破坏会损害药物诱导的MexXY的表达，而PA5471本身同时由诱导MexXY表达的相同的核糖体靶向药物进行诱导。体外条件下，外排泵通常在基础水平表达，调节子和/或抑制子的突变导致这些元件的过度表达，在MDR表型的获得和表达中起主要作用[19]。突变的调节子主要包括AcrA和AcrB，AcrA蛋白的作用主要是促进外排体系与细胞膜的融合，同时含有醛基的化合物（如肉桂醛和柠檬醛）在铜绿假单胞菌中诱导亲电应激反应，刺激MexXY-OprM主动外排，增加了细菌对泵底物抗生素的耐药性[20]。

5 外排泵MexCD-OprJ

5.1 外排泵MexCD-OprJ的作用机制 MexCD-OprJ外排泵临床上并不常见，由于编码MexCD-OprJ的操纵子在常规生长条件下表达水平非常低，主要参与铜绿假单胞菌的获得性耐药。有研究报道，由于PQS系统的前体4-羟基-2-庚基喹啉（4-hydroxy-2-heptylquinoline，HHQ）被MexCD-OprJ从菌体内排出，减少其在细菌内的积累，从而影响铜绿假单胞菌的QS系统反应，这表明PQS也可能是MexCDOprJ的底物[21]。研究表明，MexCD-OprJ外排泵的过表达可能导致铜绿假单胞菌对环丙沙星、头孢吡肟和氯霉素的耐药性增加，但同时由于MexCDOprJ外排泵对MexXY-OprM外排作用有一定影响，导致MexCD-OprJ外排泵对氨曲南、亚胺培南、氨苄西林和氨基糖苷类敏感性更高[22]。此外，MexD底物特异性的修饰可以诱导MexCD-OprJ的过度表达，从而损害AMpC和β-内酰胺酶的结构性表达。

5.2 外排泵MexCD-OprJ的基因调控机制 MexCDOprJ外排泵的调控主要由于外排泵膜蛋白MexC、MexD和OprJ表达上调，从而导致耐药性的出现。消毒剂和染料可以诱导NfxB基因的突变，该基因为MexCD-OprJ外排泵的启动子，从而导致MexCDOprJ的表达急剧增加，但这种效应不能由普通抗生素诱导产生[23]。杀菌剂、阳离子抗菌肽、洗涤剂等通过释放膜脂成分来破坏OM和/或IM，使IM相关的Muc蛋白发出信号，使依赖AlgU的Muc-AlgU复合物极不稳定[24]。因此，AlgU变得活跃，并正向调控MexCD-OprJ的表达。此外，MexCD-OprJ的生理功能可能是从受损的细胞膜中排出相关成分。最新研究显示，NfxB突变体中有7 bp缺失而新产生的nt213Δ7突变体，会引起铜绿假单胞菌对新型头孢菌素-β-内酰胺酶抑制剂组合的耐药性[25]。同时相关研究表明，MexCD-OprJ外排泵可以通过Gyr突变（主要为Gyrb突变）引起表达上调，从而导致氟喹诺酮类抗生素耐药性提高[26]。

6 外排泵MexEF-OprN

6.1 外排泵MexEF-OprN的作用机制 MexEF-OprN外排泵可以外排环丙沙星、氯霉素和甲氧苄啶等药物，但通常对环丙沙星显示出低水平耐药。主要在NfxC突变体中出现调控基因的突变引起表达上调。研究表明，MexEF-OprN外排泵的过表达可以短暂提高铜绿假单胞菌抗生素耐药性，导致该菌从抗生素暴露中存活下来从而诱发感染[27]。对于囊性纤维化患者，MexEF-OprN外排泵过度表达可以降低相关毒力因子（鼠李糖脂、弹性蛋白酶和绿脓素等）的表达，从而降低炎症反应，更好地促进铜绿假单胞菌的定植，使治疗变得困难[28]。此外，MexEF-OprN外排泵可以诱导铜绿假单胞菌QS系统中的RHL系统表达，其调控因子MexT也可影响细菌的生长[29]。

6.2 MexEF-OprN外排泵的基因调控机制 MexEFOprN外排泵有两种独立的调控途径，即MexS介导的通路和非MexS单独介导的通路。MexS介导的MexEF-OprN的复杂调控在不同铜绿假单胞菌菌株间具有差异性。其中，MexS的单点突变可以导致MexS活性部分或完全缺失，并导致铜绿假单胞菌MexEF-OprN的显著上调[30]。非MexS单独介导的通路是指MexT和MexS基因的活性影响相关底物的活性，MexT是一种LysR型转录调控因子，位于MexEF-OprN操纵子上游，而MexS基因位于MexT上游[31]。研究表明，MexT寡聚体上第257位氨基酸的取代引起的结构变化可能会影响MexEFOprN外排泵的表达[32]。此外，GyrA中D87G突变与MexS中F7S突变引起的MexEF-OprN高表达是促使铜绿假单胞菌对环丙沙星耐药的主要因素。GyrA的D87G突变使环丙沙星的MIC增加了4倍，而MexS中F7S突变引起的MexEF-OprN高表达使环丙沙星的MIC增加了8倍。同时研究表明，全局调控因子MvaT独立于MexT和MexS负调控MexEF-OprN的表达。当MvaT缺失和MexEFOprN过表达后，对氯霉素和诺氟沙星的耐药性增加，但对亚胺培南的敏感性增强[30，33]。

7 结语

由于多重耐药铜绿假单胞菌数量的日益增长，使得攻克多重耐药铜绿假单胞菌越发重要，主动外排机制是导致多重耐药铜绿假单胞菌的重要因素。RND外排泵在主动外排机制中至关重要，由于其参与调节群体感应、影响毒力因子表达、生物膜形成、细菌耐药基因突变及逆转、细菌瞬时和持久耐药性等。因此抑制其表达可恢复多重耐药铜绿假单胞菌对抗菌药物敏感性。而外排泵抑制剂主要通过竞争性抑制转运蛋白的结合位点、干扰外排泵相关蛋白进行组合、阻断供能效应、抑制底物通过外排泵通道等机制下调其表达，从而抑制主动外排。因此研究外排泵系统的作用机制和基因调节，通过抑制外排泵的表达，可以对多重耐药铜绿假单胞菌提供有效的治疗手段。