山西陈醋发酵过程微生物群落动态分析及差异菌属筛选

范三红，薛虎贵，白宝清，薛腾达，蔺佳钰，张锦华,

（1.山西大学生命科学学院，山西太原 030006；2.山西大学，特色植物资源研究与利用山西重点实验室，山西太原 030006）

食醋作为一种调味品，其生产历史悠久，因有护肝[1-2]、抗氧化[3]等功效，深受我国人民的喜爱。山西陈醋采用固态发酵方式，发酵过程中微生物生长繁殖与其代谢活动，以及特有蒸、酵、熏、淋、晒等加工工艺，使山西陈醋含有丰富的营养与呈味物质[4-5]，形成酸、绵、香、甜、鲜等标志风味。山西陈醋酿造是一个开放式，多微发酵的过程，大量微生物参与这一过程并不断进行演替，对陈醋的品质发挥重要作用[6]，有报道指出分析微生物群落结构和多样性是揭示酿造过程代谢机理的重要手段[7]。因此，研究陈醋酿造过程中微生物动态变化对提高和改善食醋品质具有重要意义。

目前，通过分离培养[8]和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）[9]等方法研究陈醋酿造过程中的微生物已经较成熟。但这些方法存在着一定缺陷，如分离培养方法由于培养环境与微生物实际生存环境不一样等因素，不能使样品中所有微生物都分离出来[9]，PCR-DGGE存在分辨率低、识别物种少等问题[10]。随着高通量测序技术的普及与应用，不仅提升了研究微生物群落组成的覆盖率和效率[11]，也极大地拓宽了人们对微生物群落组成和演替的认识。在食醋领域通过高通量测序方法分析微生物群落的研究逐渐增加，在晒醋[12-14]、永春老醋[6]、浙江玫瑰醋[15]、镇江香醋[16]、凉州熏醋[17]等均有应用。高通量测序技术在陈醋中的应用也有报道，梦燕华[18]和崔宁波[19]应用高通量测序技术分别研究了陈醋酿造过程中的细菌多样性和真菌多样性，Zhu等[20]研究了酿造过程中的醋酸发酵阶段的微生物变化，Nie等[21]系统探讨了陈醋整个酿造阶段的细菌和真菌多样性。这些研究为认识陈醋酿造过程中微生物群落变化发挥了重要作用。

与之前的研究相比，本实验选取山西陈醋发酵所用醋曲和发酵过程中的醋醅为研究对象，利用高通量测序技术不仅系统研究了山西陈醋发酵过程中细菌和真菌群落动态变化，同时也做了延伸，对酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段的差异菌属进行了探讨，为找出山西陈醋酒精酿造阶段和醋酸酿造阶段的标志微生物，以及下一步建立相应的快检方法和微生物标准体系来检验陈醋发酵有无异常提供了理论基础和保障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

醋曲、醋醅 于2021年4月～5月，在山西省阳泉市某醋厂采集同一生产批次使用的醋曲和醋醅样品；Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer New England Biolabs公 司；GeneJET胶回收试剂盒 Thermo Scientific公司；CTAB基因组DNA提取试剂盒 北京百奥莱博科技有限公司；NaH2PO4、Na2HPO4均为分析纯，天津博迪化工股份有限公司。

H2100R型台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；YXQ-LS型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司；MX-S型涡旋混合仪 北京佳航博创科技有限公司；S.SW-CJ-1FD型净化工作台 上海跃进医疗器械有限公司；SC-3614型低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；NanoBio 200型超微量分光光度计 奥普天成（厦门）科技有限公司；凝胶成像系统 北京博奥晶典生物技术有限公司；T100型PCR扩增仪 美国Bio-rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集 醋曲样品（C0）：生产所用曲块粉碎之后，采用5点取样法，充分混匀后取500 g置于无菌密封袋中，-80 ℃冰箱保存备用。

醋醅样品：分别取发酵第1 d（C1）、第3 d（C2）、第5 d（C3）、第7 d（C4）、第10 d（C5）、第13 d（C6）、第16 d（C7）、第20 d（C8）、第25 d（C9）醅样，取样点位置为醋醅表面下35 cm，采样500 g置于无菌密封袋中，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 样品预处理 样品前处理方法参照文献[22]进行，每个样品设置3个平行处理。

1.2.3 样品总DNA提取 采用CTAB法对样品进行总DNA提取，将得到的总DNA通过1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，琼脂糖凝胶电泳检测参数如下：Marker上样量2 μL，样品上样量3 μL，电泳时间40 min，琼脂糖浓度1.0%，电压100 V。

1.2.4 PCR扩增和高通量测序 检测DNA的纯度和浓度合格后，以基因组DNA为模板，采用引物

341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）/805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）和1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）/2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）分别对细菌16S rDNA V3～V4区和真菌ITS1区基因序列进行PCR扩增。PCR扩增体系30 μL：Phusion Master Mix（2×）

15 μL，Primer（2 μmol/L）3 μL，gDNA（1 ng/μL）10 μL，ddH2O 2 μL。反应程序：98 ℃预变性1 min；98 ℃10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃，5 min。扩增结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测，产物用GeneJET胶回收试剂盒回收。检测合格的扩增产物通过北京诺禾致源科技股份有限公司Illumina NovaSeq 6000平台进行高通量测序。

1.3 数据处理

下机数据首先去除barcode和引物序列，使用FLASH（V1.2.11）软件进行双端测序reads拼接。Fastp（V0.23.0）软件进行质控；Usearch（10.0.259）软件去除嵌合体；利用QIIME2（版本 2021.8）软件进行OTU（Operational Taxonomic Unit）划分并进行物种注释和Alpha多样性分析；T-test通过R软件（3.6.3）来实现；采用SPSS（IBM23）软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 Alpha多样性分析

采用Chao1指数和Simpson指数对山西陈醋发酵过程中微生物多样性进行分析。由表1可知，分析比较Chao1指数可以看出，C1样品与其他样品相比，细菌群落和真菌群落的Chao1指数最大，说明醋曲样品中所包含的细菌和真菌群落物种数最多；C2样品的Chao1指数比C1样品小，推测原因可能是由于发酵初期微生物不能完全适应发酵环境，生长和繁殖受限所致[13]。分析比较Simpson指数可以看出，细菌Simpson指数在0.587±0.072～0.918±0.213波动，真菌Simpson指数在0.494±0.115～0.827±0.549波动，变化幅度虽然不大，但也说明真菌和细菌群落结构在发酵过程中发生变化[14]。从这两个指数可以看出，山西陈醋发酵所用醋曲和醋醅的微生物群落的多样性和丰富度具有差异性。

表1 细菌和真菌Alpha多样性指数Table 1 Bacterial and fungal Alpha diversity index

2.2 不同发酵阶段Venn图分析

参考相关文献并结合本实验发酵工艺及过程将样品分为三组[17]。由于醋曲为糖化发酵剂[23]，富含的微生物是陈醋发酵的原动力，醋曲作为微生物发酵的起点，将醋曲样品（C0）设为组R1、酒精发酵阶段（C1～C4）设为组R2、醋酸发酵阶段（C5～C9）设为组R3。

由图1可知，在整个发酵过程中共检测得到细菌OTU数为344个，不同阶段的细菌OTU数为R1（77）＜R2（196）＜R3（275），存在于R1、R2和R3中特有细菌OTU数分别为14、48、131个，三个阶段共有细菌OTU数为53个，R1和R2共有的细菌OTU数为60个，R2和R3共有的细菌OTU数最多，为141个，R1和R3共有的细菌OTU数最少，为56个。三个阶段中，醋曲样品中获得的细菌OTU数最少，随着发酵的进行，细菌OTU数逐渐增加，R2细菌OTU数达到了R1两倍多，这可能是因为酒精发酵时，加入其它的原料，从而引入新的菌种[13]。其次，随着酒精发酵的进行不断涌现出新的菌种。在R3组中细菌OTU数最多，独有细菌OTU数也最多。这表明参与醋酸发酵阶段的细菌种类最为丰富，可能由于随着发酵进行，一些数量低的微生物逐渐适应发酵环境而不断富集，达到了被高通量测序检测的阈值。

图1 不同阶段细菌Venn图Fig.1 Venn diagram of bacteria at different stages

由图2可知，在整个发酵过程中共检测得到真菌OTU数为661个，不同阶段的真菌OTU数为R1（50）＜R3（234）＜R2（523），分别存在于R1、R2和R3中特有的真菌OTU数为10、416、127个，三个阶段共有的真菌OTU数为38个。R1和R2，R1和R3共有的真菌OTU数均为39个，R2和R3共有的真菌OTU数最多，为106个。三个阶段中，醋曲样品中获得的真菌OTU数最少，酒精发酵阶段中真菌OTU数最多达到峰值。这是因为经过前期的糖化作用，酒精发酵阶段养料充足，适合真菌生长繁殖，所以会使真菌种类数增多[15]。

图2 不同阶段真菌Venn图Fig.2 Venn diagram of fungi at different stages

2.3 山西陈醋发酵过程中细菌群落结构演替分析

2.3.1 基于门水平细菌群落结构演替分析 由图3可知，不管是在醋曲样品（C0）还是醋醅样品（C1～C9）中，优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），在发酵阶段一直存在，且这两个菌门在每个样本中相对丰度之和都达到了98%以上，其中，除了在C9节点中占主导地位的细菌菌门是变形菌门（Proteobacteria）外，其余样本都是厚壁菌门（Firmicutes）占主导地位，且在C4节点中厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度达到最大值，为96.5%。厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）在酒精发酵阶段，整体变化幅度不大，而在醋酸发酵阶段，厚壁菌门（Firmicutes）呈下降趋势。这一细菌含量变化规律与浙江玫瑰醋[15]研究结果类似，分析原因可能是山西陈醋在醋酸发酵前期阶段，每天都会定时翻醅来提供氧气，而变形菌门（Proteobacteria）中包含许多好氧型细菌[24]，翻醅就为这些细菌提供了有利生长环境，使其相对丰度在醋酸发酵阶段呈上升趋势，随着发酵时间的延长逐渐占据主导地位，这与永春老醋发酵过程中变形菌门（Proteobacteria）的研究结果相似[6]。

图3 陈醋发酵过程中门水平细菌相对丰度动态分析Fig.3 Dynamic analysis of phylum level bacterial relative abundance during fermentation of aged vinegar

2.3.2 基于属水平细菌群落结构演替分析 如图4，在醋曲（C0）中，优势物种为芽孢杆菌属（Bacillus）和魏斯氏菌属（Weissella），其相对丰度分别为20.7%和60.7%，还有少量的醋杆菌属（Acetobacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）被检出，分别占0.1%、1.8%和3.8%。魏斯氏菌属（Weissella）有产β-葡糖苷酶的特性，能够降解发酵原料中的纤维素[25]。同时它还具有产乳酸、产抑菌物质等[26]特性。小麦是山西陈醋制曲中的主要原料之一，富含淀粉和纤维素[27]，这为魏斯氏菌属（Weissella）的生长繁殖创造了有利条件，在制曲发酵过程中促使其成为绝对优势菌属。芽孢菌属（Bacillus）可赋予大曲丰富的酶系，如α-淀粉酶、蛋白酶等[28]，还会代谢产生许多氨基酸物质，如L-酪氨酸等物质[29]，对曲香的形成具有重要作用。

图4 陈醋发酵过程中属水平细菌相对丰度动态分析Fig.4 Dynamic analysis of relative abundance of genus level bacteria during fermentation of aged vinegar

在酒精发酵阶段（C1～C4），乳杆菌属（Lactobacillus）和魏斯氏菌属（Weissella）表现出此消彼长的变化趋势。魏斯氏菌属（Weissella）主要来源于醋曲，在此阶段呈现出持续下降的趋势，相对丰度从55.3%下降到6.4%，而乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度从24.4%上升到72.7%，表现出增长的趋势，逐渐成为优势菌群。片球菌属（Pediococcus）整体占比不大。但是，在此阶段，随着发酵的进行，其相对丰度不断增加。葡萄球菌属（Staphylococcus）、醋杆菌属（Acetobacter）和芽孢杆菌属（Bacillus）在此阶段也被检出，相对丰度整体变化幅度不大，说明这些菌属在此阶段处于相对稳定状态。其中，葡萄球菌属（Staphylococcus）是最常见的一类致病菌，可分泌毒素和酶引起假膜性肠炎等疾病[30]，分析结果发现，随着发酵的进行，其相对丰度最终下降到0.07%，含量极低。乳酸菌大部分是兼性厌氧或厌氧菌[31]，其代谢产物乳酸可以改善和调节陈醋风味，在发酵中还有调节菌群结构的作用[32]，在酒精发酵时，会把发酵缸内的原料进行压实，这样除了表层接触空气外，内部基本处于无氧状态，适合乳酸菌生长繁殖，随着酒精发酵的不断进行，发酵缸内的原料逐渐被利用，整个体系处于高乙醇环境，促使不耐高乙醇环境的细菌死亡[15]，乳杆菌属（Lactobacillus）则不断成为占据主导地位的绝对优势菌属。

在醋酸发酵阶段（C5～C9），乳杆菌属（Lactobacillus）一直是优势菌属，其相对丰度表现出先上升后下降的趋势。在C6发酵节点其相对丰度达到最大值，为81.2%；C8到C9时期，乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度下降，占比由76.8%下降到48.3%。魏斯氏菌属（Weissella）在此阶段一直下降，由4.8%下降到0.4%。这一结果表明随着发酵进行魏斯氏菌属（Weissella）逐渐无法适应酿造环境。醋杆菌属（Acetobacter）相对丰度随着发酵的进行不断上升，由C5节点的7.4%增加到C9节点的49.7%而成为整个体系的优势菌属，这与镇江香醋醋酸发酵过程中醋杆菌属（Acetobacter）变化趋势一致[16]。此外，不动杆菌属（Acinetobacter）、明串珠菌属（Leuconostoc）等菌属也被检出，这些菌属虽然相对丰度很低，但始终稳定存在于整个发酵过程中。有报道表明，不动杆菌属（Acinetobacter）中有部分致病菌可以长期存在于医疗环境以及器械中，感染人体大脑、呼吸道等部位后，可引起脑膜炎、肺炎等相关疾病[33]，部分非致病菌可以分泌产生维生素和磷脂[34]等营养物质。明串珠菌属（Leuconostoc）中存在一小部分感染后使人引起败血症等疾病的致病菌[35]，部分非致病菌可以代谢产生多种酸和醇[36]等风味物质。在本山西陈醋酿造工艺中，当酒精发酵结束后，会在每个发酵缸内接入发酵第3 d的醋醅（引醅），之后几天只是小面积的翻醅，内部相对来说仍是处于无氧环境，乳杆菌属（Lactobacillus）依旧可以生长，所以相对丰度会出现短期的上升，引醅之后，每天就会进行大面积的翻醅，确保醅料松散能够通氧，同时发酵液中的酸度值也不断降低，抑制乳杆菌属（Lactobacillus）的生长，使其相对丰度下降，而醋杆菌属（Acetobacter）是一类好养型菌属，其代谢产生的醋酸是山西陈醋中有机酸的主要成分，每天的翻醅通氧有利于其生长代谢[18]，所以相对丰度逐渐升高而起到主导作用，成为影响陈醋品质的优势菌属。

2.4 山西陈醋发酵过程中真菌群落结构演替分析

2.4.1 基于门水平真菌群落结构演替分析 图5为真菌在门水平的时序动态变化。在整个过程中共检出7个真菌门，其中优势菌门为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），子囊菌门（Ascomycota）在醋曲和之后的发酵过程中一直处于绝对优势地位，在醋曲（C0）中含量最高，相对丰度达到了98.9%。担子菌门（Basidiomycota）在C1节点迅速繁殖，相对丰度达到最高，为14.1%，在此后的发酵过程中，担子菌门（Basidiomycota）相对丰度虽有所减少，但一直稳定存在。这一结果表明该菌门真菌能够适应陈醋酿造环境，且对陈醋的酿造产生影响。

图5 陈醋发酵过程中门水平真菌相对丰度动态分析Fig.5 Dynamic analysis on relative abundance of phylum level fungi during fermentation of aged vinegar

2.4.2 基于属水平真菌群落结构演替分析 如图6，在醋曲（C0）中，优势菌属为伊萨酵母属（Issatchenkia）、曲霉属（Aspergilus）和米勒酵母属（Millerozyma），相对丰度分别为43.7%、24.4%和19.1%。这一结果与清香型大曲相似，在清香型大曲发酵过程中伊萨酵母属（Issatchenkia）和东方伊萨酵母菌（Issatchenkla orientalis）为绝对优势菌种[37]。此外，曲霉属（Aspergilus）在大曲的发酵成熟时期起着重要的作用[26]，根据之前的报道，利用高通量测序分析大米曲、糯米曲、玉米曲、小麦曲和高粱曲的真菌群落结构时，曲霉属在这五种曲中都有被检出[38]，与本研究结果相近。

图6 陈醋发酵过程中属水平真菌相对丰度动态分析Fig.6 Dynamic analysis of relative abundance of genus level fungi during fermentation of aged vinegar

在酒精发酵阶段（C1～C4），伊萨酵母属（Issatchenkia）和曲霉属（Aspergilus）仍然是主要的优势菌属。伊萨酵母属（Issatchenkia）在酒精发酵前期（C1和C2）呈现上升趋势，相对丰度由43.8%上升到67.2%，之后进入稳定期，无明显变化。现有报道指出，酵母菌属（Saccharomyces）是陈醋酒精发酵阶段的主要真菌菌属[19,21]，与本研究结果有差异，推断原因可能为陈醋生产所用原料不同所致。伊萨酵母属（Issatchenkia）是一种比较重要的非酿酒酵母，因在发酵时具有耐乙醇、耐酸和耐高温以及能代谢产乙醇和乙酸乙酯的特点[39]而受到人们关注，发酵前期原料相对充分，有利于酵母代谢，所以该菌属迅速繁殖，出现短暂上升，随着发酵的进行，微生物适应了体系的环境，便会趋于稳定[40]。曲霉属（Aspergilus）在此阶段波动变化，相对丰度维持在6.7%～23.6%之间，该菌属能够产生糖化酶、淀粉酶[41-42]，对原料中的淀粉起到很好的糖化作用，相关研究表明曲霉属（Aspergilus）还与异戊醇、异丁醇、乙酸乙酯等风味物质有关[43]。此外，小菇属（Mycena）只有在这个阶段被检出，小菇属真菌最主要的作用是用于人工栽培天麻的萌发真菌类群，近些年，因具有食用、药用价值而被人们所关注[44]。

在醋酸发酵阶段（C5～C9），伊萨酵母属（Issatchenkia）仍然是主要菌属，在此阶段呈现出先上升后下降的趋势，在C6发酵节点，相对丰度达到峰值，占比为81.3%。由于霉菌的细胞壁结构为：外层β-葡聚糖，中层糖蛋白，内层几丁质；酵母的细胞壁结构为：内层为葡聚糖层，中间层主要由蛋白质组成，外层为甘露聚糖层，在酸性条件下这种“三明治型”细胞壁结构仍能稳定存在而不被破坏[45]，所以，伊萨酵母属（Issatchenkia）和曲霉属（Aspergilus）在醋酸发酵阶段仍能存在。小菇属（Mycena）在此阶段并未检出，可能醋酸发酵阶段的高酸性环境并不适合其生长繁殖，还有一些相对丰度虽然较低的菌属，但是适应环境的能力较强，在整个发酵过程中都有被检出，如米勒酵母属（Millerozyma）、枝孢属（Cladosporium）、棒孢酵母属（Clavispora）、假丝酵母属（Candidia）等，这些菌属在酿造中也发挥了作用，如枝孢属（Cladosporium）可以产纤维素酶[46]，假丝酵母属（Candidia）有很好的发酵能力和耐酒精能力，可以水解还原糖生成乙醇，乙酸乙酯和柠檬酸等物质[47]。

2.5 两大发酵阶段差异菌属筛选

据之前报道，Zhu等[20]将山西陈醋醋发酵阶段分为前期、中期和末期三个时期，并找出这三个时期的差异显著细菌菌属，进一步加深了人们对醋酸发酵阶段的认识。目前对酒精发酵阶和醋酸发酵阶段的潜在差异菌属的研究较少。针对这一关键问题，本研究进行组间T-test分析，将进一步研究找出这两大酿造阶段的潜在差异显著菌属。由图7和图8可知，两大发酵阶段（R2表示酒精发酵阶段，R3表示醋酸发酵阶段）在属水平共发现6个差异显著菌属，其中包括5个细菌菌属和1个真菌菌属，分别为葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、土芽孢杆菌属（Geobacillus）和曲霉属（Aspergillus）。

图7 细菌群落结构的T-test分析Fig.7 T-test analysis of bacterial community structure

图8 真菌群落结构的T-test分析Fig.8 T-test analysis of fungal community structure

3 结论

本研究通过以山西陈醋发酵所用醋曲和醋醅为研究对象，利用高通量测序技术对样本细菌16S rDNA V3～V4区域和真菌ITS1区域进行检测，从而对山西陈醋酿造过程中的微生物动态变化进行探究。结果表明，在醋曲（R1）中，主要的细菌菌属为芽孢杆菌属（Bacillus）和魏斯氏菌属（Weissella），主要真菌菌属为伊萨酵母属（Issatchenkia）、曲霉属（Aspergilus）和米勒酵母属（Millerozyma）。其中，芽孢杆菌属（Bacillus）和魏斯氏菌属（Weissella）为醋曲赋予了α-淀粉酶、蛋白酶等丰富的霉系，对曲香的形成发挥了重要的作用。因此，在制作醋曲时应注重对这些菌属的检测以保证醋曲的质量。在酒精发酵阶段（R2），乳杆菌属（Lactobacillus）逐渐减少，魏斯氏菌属（Weissella）逐渐增多，伊萨酵母属（Issatchenkia）和曲霉属（Aspergilus）是主要的真菌菌属，特别地，小菇属（Mycena）仅在此阶段被检出，其在酒精发酵的代谢机理不明确，仍需进一步探讨。在醋酸发酵阶段（R3），乳杆菌属（Lactobacillus）和醋杆菌属（Acetobacter）是主要细菌菌属，伊萨酵母属（Issatchenkia）仍然是主要真菌菌属，枝孢属（Cladosporium）、假丝酵母属（Candidia）等菌属虽然相对丰度较低，却存在于整个发酵过程，对陈醋的品质发挥作用，后续进一步重视对这些低丰度菌属的研究。通过T-test分析发现，葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、土芽孢杆菌属（Geobacillus）和曲霉属（Aspergillus）为酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段的差异菌属，为下一步建立快检方法奠定了基础，也为山西陈醋产品的发展和品质革新提供了理论支撑。