QuEChERS-同位素质谱内标法检测动物源性食品中20种头孢菌素的残留量

徐 幸，张 燕，舒 平，杨卫花

（大理州质量技术监督综合检测中心，云南大理 671000）

Key words：cephalosporins；isotope internal standard；LC-MS/MS；animal derived food孢菌素对革兰氏阳性菌有抑制作用，能让细菌在增殖阶段死亡[1-2]，因其具有抗菌谱宽、抗菌效果强的特点，常被饲养者用于动物疾病的预防和治疗。然而，不加控制地使用头孢菌素可能导致其在动物源性食品中残留累积，使消费者被动地吸收此类药物[3-4]。头孢菌素的残留对人体和环境会产生以下影响：首先，干扰肠道正常菌群，导致菌群失调[5]；其次，诱导产生耐药病原体菌株，使用抗生素治疗的病人引起不良反应[6-8]；最后，动物排泄物中头孢菌素耐药菌株释放到环境后会污染水体和土壤，并在污泥中长期保持耐药性[9]。

为减少抗生素残留给消费者带来的影响，欧盟、美国和日本都对动物源性食品中的头孢菌素残留规定了限量[10]。日本限制使用的头孢菌素类数量最多、最严格。在中国，GB 31650-2019《国家食品安全标准 食品中兽药最大残留限量》对头孢菌素类（头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋）的最大残留限量进行了规定（见表1）。因此，建立检测多种头孢菌素及其代谢物残留的方法具有重要意义。目前，对β-内酰胺类抗生素的检测分析研究多集中于医药和环境领域[11-15]，而食品领域中大多数的研究文献是关于食品中青霉素类的分析检测，对头孢菌素类的分析检测文献相对较少[16-18]。现有的关于头孢菌素的检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）[19-21]。通常传统的HPLC-MS/MS法前处理方法步骤繁琐，如旋转蒸发器浓缩、固相萃取柱净化、氮吹浓缩等步骤[22-24]。这些净化方法费力又费时，需要使用大量的有机溶剂。因此，开发省时、方便、可靠的预处理技术已成为研究热点。

表1 食品中头孢菌素最大残留限量（中国）Table 1 Maximum residue limits for cephalosporins in foods(China)

本文拟采用多个同位素内标作为定量方式建立分析市售消费量较大的动物源性食品（猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉）中多种头孢菌素的残留量，并对提取溶剂和净化材料进行了优化，最终，采用QuEChERS前处理技术结合液相色谱串联质谱分别扫描正、负离子的模式，测定20种头孢菌素残留的方法，并以此方法在实际样品中进行了验证分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

46份猪肉样品、38份牛肉样品、43份鸡肉样品、26份鱼肉样品 市售；头孢氨苄（纯度≥98%）、头孢地尼（纯度≥95%）、头孢克肟（纯度≥98%）、头孢唑啉（纯度≥97%）、头孢喹肟（纯度≥97%）、头孢他啶（纯度≥90%）、头孢曲松（纯度≥97%）、头孢地嗪（纯度≥97%）、头孢替唑（纯度≥97%）、头孢噻吩（纯度≥98%）、头孢呋辛（纯度≥97%）、头孢西丁（纯度≥97%）等标准品 中国食品药品检定研究院；头孢拉定（纯度≥97%）、头孢匹林（纯度≥97%）、头孢哌酮（纯度≥98%）、头孢洛宁（纯度≥97%）、头孢匹罗（纯度≥97%）、头孢噻呋（纯度≥98%）、头孢呋辛酯（纯度≥97%）等标准品 德国Dr.Ehrenstorfer公司；去呋喃甲酰基头孢噻呋（纯度≥90%）、头孢呋辛D3（纯度≥97%）、头孢匹林D4（纯度≥97%）、头孢氨苄D5（纯度≥98%）等标准品 加拿大TRC公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（C18）吸附剂、0.22 μm尼龙针滤头 上海安谱科学仪器有限公司；甲酸（色谱纯） Acros公司；乙腈、丙酮、甲醇、乙醇 均为色谱纯，德国Merck公司；Ascentis C8色谱柱（规格为10 cm×4.6 mm，3 μm）Supelco公司；其他试剂 均为分析纯。

QTRAP 4500高效液相色谱-串联质谱仪 AB SCIEX公司；88880018型涡旋振荡器 Thermo公司；Direct-Q3超纯水机 Millipore公司；AL204型电子天平 Mettler toledo公司；TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准储备液的配制 准确称取头孢菌素标准品各10 mg（精确值0.1 mg），由于各标准品的溶解性不同，分别采用不同溶剂溶解并定容至100 mL，配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液。头孢氨苄、头孢氨苄D5、头孢拉定、头孢匹林、头孢匹林D4、头孢洛宁、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢地嗪、头孢替唑、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢呋辛D3等标准品采用超纯水溶解；头孢地尼、头孢克肟、头孢唑啉、头孢西丁、头孢噻呋、头孢呋辛酯、去呋喃甲酰基头孢噻呋等标准品采用甲醇溶解；头孢哌酮采用丙酮溶解。

1.2.2 样品前处理 称取5.00 g绞碎的样品于50 mL离心管中，加入100 μL内标溶液（质量浓度为1.0 mg/L），加入10 mL甲醇涡旋混匀提取1 min，振荡混匀，以转速5000 r/min离心5 min，吸取2 mL上清液于10 mL离心管中，添加150 mg的C18吸附剂，充分振荡1 min。将上清液采用0.22 μm尼龙针滤头过滤，得到待检测液，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.3 仪器分析条件 流动相：A为体积浓度为0.1%的甲酸溶液，B为乙腈。

液相色谱洗脱条件（正模式）：0～1.0 min，5% B；

1.0～8.0 min，5%～95% B；8.0～10.0 min，95% B；10.0～10.1 min，95%～5% B；10.1～14.0 min，5% B。

液相色谱洗脱条件（负模式）：0～1.0 min，40%B；1.0～3.0 min，40%～95% B；3.0～3.1 min，95%～5%B；3.1～7.5 min，5% B。

流速：0.50 mL/min；进样量：1 μL；柱温：40 ℃。

质谱条件：离子源为ESI源；喷雾电压：5500 eV；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：450 ℃；扫描方式多重反应监测模式（MRM）条件见表2。

表2 多反应监测条件Table 2 Parameter of MRM

1.2.4 方法验证

1.2.4.1 标准曲线的绘制 采用甲醇/水（体积比1:2）混合溶剂稀释标准储备液，由于各标准物质在仪器上的响应值不同，分别配制成高响应值的头孢菌素混合标准溶液（17种），质量浓度为5、10、20、40、60、80、100 μg/L的标准曲线，低响应值的头孢菌素混合标准溶液（3种，头孢匹罗、头孢喹肟、头孢曲松），质量浓度为25、50、100、200、300、400、500 μg/L的标准曲线。准确吸取头孢呋辛D3、头孢匹林D4、头孢氨苄D5等内标储备液，配制进各质量浓度水平的混合标准溶液，得到内标的质量浓度为10 μg/L，供液相色谱-串联质谱联用仪测定，以头孢菌素与同位素内标的质量浓度比值为横坐标，头孢菌素与同位素内标的峰面积比值为纵坐标来绘制标准曲线。

1.2.4.2 添加回收实验 分别在不同基质样本中（猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉）添加3个水平浓度的标准溶液，根据各标准物质在仪器上的响应值，17种响应值较高的化合物（头孢氨苄、头孢拉定、头孢匹林、头孢洛宁、头孢他啶、头孢地嗪、头孢替唑、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢地尼、头孢克肟、头孢唑啉、头孢西丁、头孢噻呋、头孢呋辛酯、去呋喃甲酰基头孢噻呋、头孢哌酮）添加水平为10、40、80 μg/kg，3种响应值较低的化合物（头孢匹罗、头孢喹肟、头孢曲松）添加水平为50、200、400 μg/kg。

1.3 数据处理

采用HPLC-MS/MS进行分析检测，每个样品进样测试2次，HPLC-MS/MS数据采集使用AB SCIEX Analyst software软件，数据的统计分析采用Microsoft Excel 2007软件，处理数据和绘图采用Origin 8.0和Photoshop CS6软件。

2 结果与分析

2.1 HPLC-MS/MS仪器分析条件的优化

采用HPLC-MS/MS分析的过程中，流动相的组成会影响化合物的峰形和响应值。本文考察了4种流动相组合模式的分析效果，分别为：水和乙腈、水和甲醇、0.1%甲酸水溶液和乙腈、5 mmol/L醋酸铵水溶液和乙腈。结果表明，大多数化合物在0.1%甲酸水溶液和乙腈流动相体系中的峰形和响应值都较好，最终，选择0.1%的甲酸水溶液和乙腈体系作为本实验分析的流动相。

本实验尝试采用相同的梯度洗脱程序同时扫描正、负离子，然而效果并不理想，因此，经过优化梯度洗脱程序，本文采用不同的梯度洗脱程序分别扫描正、负离子，正离子扫描模式洗脱程序用于分析14个头孢菌素和2个同位素内标（头孢氨苄D5和头孢匹林D4），负离子扫描模式洗脱程序用于分析6个头孢菌素和1个同位素内标（头孢呋辛D3），头孢菌素的离子对扫描条件见表2中，各种头孢菌素化合物的多反应监测MRM色谱图如图1所示。

图1 头孢菌素标准溶液的多反应监测色谱图Fig.1 MRM chromatograms of cephalosporins standard solution

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂和吸附剂的选择 头孢菌素的极性与其分子结构中含有的官能团有关，大多数头孢菌素可以溶解于极性溶剂。在本实验中，考察了3种极性溶剂从动物源性食品基质中提取头孢菌素的效果，分别为乙腈、甲醇、乙醇。同时，采用C18和PSA吸着剂作为净化材料来减少由基质引起的干扰，C18吸附剂由于碳含量占比10%而具有疏水性，可以吸附非极性和弱极性的物质，主要是样品中的脂类、多环芳烃和邻苯二甲酸酯类。PSA吸附剂有弱阴离子交换作用、极性相互作用和络合作用，可以吸附各种极性色素、脂肪酸和有机酸[25]。如图2所示，采用乙腈作提取溶剂时，多种头孢菌素的回收率都很低，而采用甲醇与乙醇作提取溶剂时，回收率更高。此外，与采用PSA相比，采用C18作为净化吸附剂的回收率相对较高。结果显示，大多数头孢菌素可能被PSA吸附，分析原因可能是PSA吸附剂的氨基与头孢菌素的羧基发生相互作用有关（如图3所示），而C18吸附剂含有的烷基则不会与头孢菌素发生这种相互作用。因此，本实验最终选择甲醇为提取溶剂，采用C18吸附剂作为净化材料。

图2 不同提取溶剂和吸附剂对头孢菌素回收率的影响Fig.2 Effects on recovery of cephalosporins under different solvent and sorbent

图3 C18和PSA吸附剂作用于头孢菌素的可能机制Fig.3 Possible mechanism for C18 and PSA sorbents on cephalosporins

2.2.2 吸附剂用量的优化 本实验考察了使用不同剂量的吸附剂对头孢菌素回收率的影响，采用C18吸附剂作为净化材料时，吸附剂使用量的变化对大多数头孢菌素的回收率没有影响，而有5种头孢菌素的回收率会受到影响，如图4所示，当C18吸附剂的使用量从75 mg增加到200 mg的过程时，5种头孢菌素（头孢地尼、头孢克肟、头孢曲松、头孢地嗪和头孢西丁）的回收率逐渐增加，导致这种现象的原因可能与这5种头孢菌素的分子量较大，含有的氨基较多，提取液中一些脂类物质可能会与头孢菌素的氨基发生相互作用，使这些头孢菌素被杂质吸附，导致回收率较低，而当使用C18吸附剂净化处理样品提取液时，提取液中的脂质与C18吸附剂发生相互作用，使最初与脂质发生作用的头孢菌素被释放出来，从而提高了回收率。作为对比实验，也采用相同的实验方法考察PSA吸附剂对头孢菌素的影响，结果表明，大多数头孢菌素的回收率随着PSA吸附剂用量的增加而逐渐降低（图4），这也进一步验证了上一步实验的推论，PSA吸附剂会与头孢菌素发生相互作用。考虑到净化效果和节约因素，最终本实验采用150 mg的C18吸附剂用于净化提取液。

图4 不同剂量的吸附剂对头孢菌素回收率的影响Fig.4 Effects of different dosage of sorbent on recovery rate of cephalosporins

2.3 方法验证

2.3.1 基质效应 基质是除被测组分以外的其他物质，如磷脂、胆固醇和其它内源性物质，当这些组分进入质谱仪时，液滴蒸发产生的气体离子可能与液体表面的目标离子发生竞争作用，这将导致目标离子的电离效率减少或增强，然后导致目标物响应值的减少或增加[26-27]，这种现象就是基质效应。本实验中，头孢菌素基质效应的计算方法为：基质配制标准曲线的斜率与溶剂配制标准曲线斜率的比值[25]。如表3所示，本实验中的20种头孢菌素的基质效应从0.368到0.768不等，这个结果表明，在动物源性食品中，样品的基质效应是明显的，因此，为减少基质效应带来的影响，采用添加稳定性同位素内标的方法来解决这个问题。

表3 不同动物源性样品的基质效应Table 3 Matrix effect for cephalosporins in different animal derived matrices

2.3.2 线性方程、检出限和定量限 头孢菌素的线性方程采用外标物与内标物的比值绘制，各线性方程见表4，其中X是头孢菌素外标物质与同位素内标的质量浓度比值，Y是头孢菌素外标物质与同位素内标的峰面积比值，本实验一共使用了3种同位素物质作为内标，每一种化合物对应使用的具体内标物见表4，线性方程的决定系数（R2）范围从0.9913到0.9998。方法检出限（LOD）为3倍信噪比的检测浓度，定量限（LOQ）为10倍信噪比的检测浓度，根据仪器的检测信号值，这20种头孢菌素LOD的范围为1.0～20.0 μg/kg，LOQ的范围为3.0～60.0 μg/kg。

表4 线性方程、检出限和定量限Table 4 Linear equation, LOD and LOQ of cephalosporins

2.3.3 准确度和精密度 以准确度和精密度评价方法的有效性，对20种头孢菌素分别在4种基质（猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉）中，添加3个浓度水平的回收实验，每个浓度水平进行6次平行实验。回收率结果见表5，在不同基质中，头孢菌素的平均回收率范围在78.08%～115.47%之间，相对标准偏差（RSD）的范围为3.07%～12.44%，回收率实验表明，该方法的准确度和精密度满足实验要求。

表5 不同基质中头孢菌素的回收率和精密度（n=6）Table 5 Recovery and RSD of the cephalosporins in different matrices (n=6)

2.3.4 方法在实际样品中的应用 为验证稳定同位素质谱内标法测定动物源性食品中20种头孢菌素的可行性，从当地市场上采集了46个猪肉样品、38个牛肉样品、43个鸡肉样品和26个鱼肉样品，以本实验建立的检测方法进行分析，结果显示，在2个

鱼肉样品中检出头孢匹林，含量分别为7.3和12.1 μg/kg，不符合现有对食品中头孢菌素残留的规定，未检出其它头孢菌素，出现这个结果可能是由于养殖鱼类的过程中使用了头孢匹林，或者鱼类生活的水体被污染了。

3 讨论与结论

本文以甲醇作为提取溶剂，以C18吸附剂作为净化材料用于动物源性食品的前处理，结合同位素质谱法分析检测了20种头孢菌素，并对前处理和仪器参数进行了优化，最终，建立了同位素质谱内标法测定动物源性食品中20种头孢菌素的方法，并对方法进行了验证。结果表明，本文所建立检测方法的线性方程、准确度、精密度和检出限等参数都满足检测需求，在实际样品中的应用效果较好。表明该检测方法是准确可靠、简便的，可用于日常对动物源性食品中的头孢菌素的监测分析。由于目前国家标准GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》仅对3种头孢菌素类（头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋）在牛、猪等食品中的最大残留限量进行了规定，本文对其它类型的头孢菌素也进行检测分析，并扩展到其它类型的样品（鸡肉、鱼肉），对进一步了解市场上动物源性食品中头孢菌素的残留情况具有现实意义，受同位素标准物质的种类限制，部分化合物使用同位素内标的回收率还有待提高，今后如果有更多的同位素标准物质可以选择，会更加完善此法的效果。