金银花黄酮提取物的降血糖作用

戴丛书，柴晶美，林长青

（延边大学医学院中医系，吉林延吉 133000）

金银花（Lonicera japonicaThunb.），有金银藤、银花、忍冬等别称，是忍冬科忍冬属多年生常绿植物。金银花原产于东亚（包括中国、韩国和日本）[1]，现在新西兰、澳大利亚、阿根廷、墨西哥、巴西和美国等许多国家均有种植。金银花富含多种活性成分，如黄酮类、有机酸、挥发油、三萜皂苷类等[2-3]，众多研究表明，金银花具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、抗氧化、护肝等生物学功能[4-8]。因此，金银花被视为天然活性物质的重要来源。黄酮类化合物为金银花的主要活性成分，研究表明，黄酮类化合物具有丰富的药理活性，如抗菌、抗氧化、促进细胞代谢、增强机体免疫力等[9]。金银花中目前鉴定出的黄酮类化合物包括木犀草素、忍冬苷等[10-11]。

糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，影响着全球的数百万人。若管理不当，可能导致危及生命的并发症、器官衰竭和死亡。其中1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus，T1DM）是由于胰岛β细胞完全或部分破坏而导致的一种慢性自身免疫性疾病。T1DM发病机制复杂，受遗传、环境、免疫等诸多因素的影响[12-14]。临床糖尿病物治疗药物主要包括胰岛素促泌剂、胰岛素增敏剂、双胍类、胰岛素及胰岛素类似物等，均可发挥一定的降糖效果，促进血糖水平的控制[15]。已有研究表明，许多药物可用于糖尿病的治疗和预防，但它们长期使用会产生很多副作用[16]，因此，目前已转向对药用植物和草药的研究。

目前有关金银花黄酮的报道多集中在黄酮提取工艺的研究[17-18]，而对金银花黄酮降血糖作用还鲜有报道。另外治疗糖尿病的药物还存在很多副作用，使得开发药食同源的植物替代传统药物显得尤为重要。因此，本文拟选用药食同源的植物金银花为对象，研究金银花黄酮提取物的降血糖作用，旨在为糖尿病的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金银花 延吉市海兰江药店；芦丁 批号：Y16 M9S61523，上海源叶生物有限公司；C57BL/6小鼠

雄性，50只，体重（20±5）g，长春亿斯试验动物中心，合格证书：SCXK（吉）2018-0007，符合《延边大学实验动物伦理守则》，获得延边大学实验动物伦理委员会批准；无水乙醇、亚硝酸钠 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；链脲佐菌素（STZ） 99.9%，批号：WXBC8740V，美国Sigma公司；盐酸二甲双胍片 95.0%，中美上海施贵宝制药有限公司；TC、TG、HDL-C、LDL-C检测试剂盒、SOD、CAT、GSH、MDA检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8 Elisa试剂盒、HE染色试剂盒北京索莱宝科技有限公司。

HH-4型四孔数显恒温水浴锅 江苏科析仪器有限公司；CCA-1111-CE型旋蒸冷凝器 东京理化器械株式会社；101A-1E型电热鼓风干燥箱 上海安亭科学仪器有限公司；580型血糖仪 江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；SuPerMax 3100型多功能酶标仪 上海闪谱生物科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金银花总黄酮提取 将金银花烘干并粉碎过40目筛，参照田存章等[19]的方法并进行修改，取金银花粉末200 g，按1:20（g:mL）的料液比加入75%乙醇溶液，50 ℃，超声功率250 W，提取温度50 ℃，超声时间30 min，提取3次，过滤，合并提取液，减压浓缩，按1:1的比例加入石油醚洗涤3次，乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩干燥，4 ℃保存备用。

1.2.2 总黄酮含量测定 将芦丁标准品配制成0.2 mg/mL，分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于10 mL容量瓶中并定容，采用NaNO2-Al（NO3）-NaOH法[20]，测定溶液在510 nm处的吸光度，并绘制标准曲线。取金银花黄酮提取物1 g溶于1 mL无水乙醇中，并定容至10 mL，将溶液稀释100倍，使其吸光度在0.2～0.8范围内，按照上述方法测定510 nm吸光度，按公式（1）计算样品中总黄酮含量。

式中：F为总黄酮含量，mg/g；C为提取液中总黄酮质量浓度，mg/mL；d为稀释倍数；V为提取液定容体积，mL；M为金银花提取物质量，g。

1.2.3 试验动物分组及给药 小鼠在温度25±2 ℃，湿度55%环境中适应性喂养1周，10只作为正常组，其余40只一次性腹腔注射STZ（130 mg/kg·BW）建立T1DM模型，72 h后，隔夜禁食不禁水，共禁食12 h，尾尖取血，弃掉第一滴血，用血糖仪进行测量，空腹血糖值≥11.1 mmol/L视为造模成功，并将造模成功小鼠其随机分为模型组、金银花黄酮提取物低剂量组（200 mg/kg）、金银花黄酮提取物高剂量组（400 mg/kg）、阳性组（二甲双胍200 mg/kg）[21]，每组10只，连续灌胃8周，正常组和模型组灌以等量蒸馏水，试验期间每天测量小鼠体重，每两周记录所有小鼠的空腹血糖值（FBG）。

1.2.4 小鼠OGTT测定 实验最后一天各组小鼠给予等量的葡萄糖溶液，灌胃后0、30、60、90 min分别测定各组小鼠血糖值[22]。

1.2.5 小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C测定实验最后一天，对小鼠采取心脏取血，并脱颈处死，血液室温静置2 h，3000 r/min离心10 min，取上清得血清，依次按各项指标试剂盒说明书进行操作。

1.2.6 小鼠肝脏组织SOD、GSH、CAT、MDA测定

小鼠脱颈处死后，取肝脏并称重，按肝脏:生理盐水为1:3的比例制备成组织匀浆，并按试剂盒说明书依次加入反应液进行孵育，测定肝脏组织中SOD、GSH、CAT、MDA活性。

1.2.7 小鼠血清炎症因子的测定 将收集好的血清使用酶联免疫吸附（ELISA）法进行炎症因子的测定，根据试剂盒说明书检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6炎症因子。

1.2.8 小鼠肝脏组织病理学检测 采用苏木精和伊红（HE）染色法分析肝脏组织病理变化，对取出的小鼠肝脏组织用4%多聚甲醛溶液固定，再进行脱水包埋切片，用HE法染色并拍照。

1.3 数据处理

使用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析和显著性差异分析，结果以均值±标准偏差表示，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 金银花黄酮提取物对糖尿病小鼠体重、FBG的影响

金银花黄酮提取物总黄酮含量为43.62 mg/g，图1反映了金银花黄酮提取物对T1DM小鼠体重以及FBG的影响，灌胃8周后，与正常组相比，模型组小鼠体重极显著降低（P＜0.01），经金银花黄酮提取物治疗后的T1DM小鼠体重均与模型组有极显著差异（P＜0.01）。经8周的金银花黄酮提取物灌胃后，各小鼠的FBG差异显著（P＜0.05），其中金银花黄酮提取物高剂量组FBG下降最为显著，可能是由于金银花黄酮提取物影响了胰岛细胞，使其分泌出更多胰岛素，从而T1DM小鼠的糖尿病症状得以缓解。可见金银花黄酮提取物能有效缓解T1DM小鼠体重的下降，调节其血糖水平。

图1 金银花黄酮提取物对T1DM小鼠体重及FBG的影响Fig.1 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on body weight and FBG of T1DM mice

2.2 金银花黄酮提取物对糖尿病小鼠OGTT的影响

由图2可知，各组小鼠血糖值在灌胃后30 min达到最大值，随后下降，模型组中血糖下降缓慢，与模型组相比，金银花低、高剂量组均能够极显著降低小鼠血糖水平（P＜0.01），能够提高T1DM小鼠的糖耐量。经金银花黄酮提取物灌胃后，调节了T1DM小鼠体内各种酶的活性，平衡了对葡萄糖的摄取及利用，提高了其对葡萄糖的耐受能力[23]。杨思等[24]的研究中指出，苦荞黄酮具有显著的降血糖效果。可见，黄酮类物质具有调节血糖的能力，具有很好的提高葡萄糖耐受的作用。

图2 金银花黄酮提取物对T1DM小鼠OGTT的影响Fig.2 Effect of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on OGTT of T1DM rats

2.3 金银花黄酮提取物对糖尿病小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响

由图3可知，与正常组相比，模型组小鼠血清的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平有极显著性差异（P＜0.01）；与模型组相比，金银花黄酮低剂量组TC无显著性差异（P＞0.05），而金银花黄酮低剂量组的TG、HDL-C、LDL-C均有极显著性差异（P＜0.01）。经金银花黄酮高剂量组治疗后能够极显著改善TC、TG、HDL-C、LDL-C相关指标的水平（P＜0.01）。这是由于金银花黄酮提取物经体内吸收后参与了T1DM小鼠的脂代谢，使TC、TG、LDL-C水平降低，HDLC水平提高。有研究指出，经治疗后的T1DM小鼠脂代谢水平能够得到明显改善，这与本研究结果一致[25]。王佳慧[26]的研究指出，川木瓜黄酮能够改善T1DM小鼠的异常脂代谢，说明植物黄酮具有调节异常脂代谢的作用，也更加确定金银花黄酮提取物能够改善T1DM小鼠异常脂代谢。

图3 金银花黄酮提取物对T1DM小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响Fig.3 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on TC, TG, HDL-C and LDL-C in T1DM mice

2.4 金银花黄酮提取物对糖尿病小鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影响

图4反映了金银花黄酮提取物对T1DM小鼠氧化应激相关指标的影响，与正常组相比，模型组小鼠肝脏中SOD、GSH、CAT含量均极显著下降（P＜0.01），MDA含量极显著升高（P＜0.01），经金银花黄酮提取物治疗后可有效恢复T1DM小鼠的氧化应激水平。有研究显示，经治疗后的T2DM大鼠SOD、GSH、CAT、MDA水平均得到恢复，与模型组差异极显著（P＜0.01），可见，金银花黄酮提取物能够通过改善机体氧化应激相关酶水平从而发挥降血糖作用[27]。

图4 金银花黄酮提取物对T1DM小鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影响Fig.4 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on SOD, GSH, CAT and MDA in T1DM mice

2.5 金银花黄酮提取物对糖尿病小鼠TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的影响

图5为金银花黄酮提取物对T1DM小鼠TNFα、IL-1β、IL-8和IL-6的影响，由图5可知，与正常组相比，模型组T1DM小鼠炎症因子含量均有升高，极显著高于正常组（P＜0.01），而经金银花黄酮提取物治疗后的T1DM小鼠炎症因子水平均极显著下降（P＜0.01），且高剂量组效果与阳性组相当。表明金银花黄酮提取物能够降低T1DM小鼠炎症的发生。吕品等[28]通过网络药理学研究指出，金银花具有抗炎抗菌活性，由此也印证了本文的实验结果。因此，金银花黄酮提取物能够降低T1DM小鼠的炎症反应，有助于治疗糖尿病。

图5 金银花黄酮提取物对T1DM小鼠TNF-α、IL-1β、IL-8 and IL-6的影响Fig.5 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on TNF-α, IL-1β, IL-8 and IL-6 in T1DM mice

2.6 金银花黄酮提取物对T1DM小鼠肝脏的影响

图6为金银花黄酮提取物对T1DM小鼠肝脏的影响，HE染色结果显示模型组小鼠肝细胞肿胀，排列紊乱，肝小叶结构消失，细胞内出现大量脂肪空泡，局部伴有炎症细胞浸润，出现了明显的肝损伤，而金银花黄酮提取物组肝脏结构基本正常，细胞内有少量脂肪空泡及脂滴，炎症细胞浸润较少，可见，金银花黄酮提取物能够明显减轻模型小鼠肝脏结构的改变，病理损伤明显减轻。刘畅等[29]基于网络药理学，对金银花对大鼠急性酒精性肝损伤进行了研究，认为金银花对肝损伤具有一定的改善作用，与本文的研究结果相符。

图6 金银花黄酮提取物对T1DM小鼠肝脏的影响Fig.6 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on liver of T1DM mice

3 讨论与结论

近年来，研究者们不断地从金银花中分离提取出有机酸类、挥发油类、黄酮类等化合物，在刘昌平[30]的研究中发现，金银花中黄酮类化合物的含量约占金银花干重的7.2%。本实验中，测得所提取的总黄酮含量为44.3 mg/g。由此可见，黄酮类化合物在金银花中含量较高，而且黄酮类物质有许多生理活性，还具有用量少、安全无毒等优点，因此，对金银花的开发前景较为广阔。

黄酮类物质易溶于乙酸乙酯中，因此在提取时选用乙酸乙酯进行萃取。实验结果显示，金银花黄酮提取物能够缓解T1DM小鼠体重的下降，降低其FBG，提高OGTT，表现出良好的降血糖作用。梅桂雪等[31]研究发现，黄酮类化合物可以通过抑制美拉德反应，增强机体对葡萄糖的摄取，抑制醛糖还原酶，促进胰岛素的分泌，控制胰岛素敏感性，作用于血管紧张素，抑制α-葡萄糖苷酶，类胰岛素作用等，发挥防治糖尿病的作用。朱小峰等[32]对金银花不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性进行了研究，结果表明金银花水提物对其抑制率较低，而总浸膏和乙酸乙酯提取物的抑制率可高达108.09%和102.81%，可见金银花乙酸乙酯提取物即黄酮类物质在体外表现出一定的降血糖活性。金银花黄酮提取物还显示出良好的调节T1DM小鼠脂代谢相关指标TC、TG、HDL-C、LDL-C的效果，有研究报道，金银花水提物能够显著降低高血脂小鼠的TC、TG水平，并调节脂代谢相关蛋白的表达[33]。王强等[34]研究发现金银花黄酮提取物（4.2 g/kg）可使高脂血症大鼠血清及肝组织TG水平明显降低。这些均与本文研究结果一致。

糖尿病在发生过程中常伴随着炎症反应，研究人员在糖尿病早期的肥胖小鼠体内，发现巨噬细胞侵入胰腺，并释放出大量促炎蛋白，从而破坏了产生胰岛素的β细胞[35]。可见，炎症引起的免疫反应，会影响胰岛素分泌情况，进而导致糖尿病的发生。而糖尿病反过来，又会进一步恶化炎症。本实验测定了金银花黄酮提取物对小鼠炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-6的影响，结果显示金银花黄酮提取物能够有效地抑制糖尿病引起的炎症反应。本文又检测了T1DM小鼠肝脏组织的病理变化，模型组小鼠肝脏局部伴有炎症细胞浸润，出现了明显的肝损伤，而金银花黄酮提取物治疗后改善了炎症细胞浸润状态，可见，金银花黄酮提取物能够明显减轻T1DM小鼠肝脏炎症。有研究指出，抑制T1DM小鼠炎症反应，可以有效抑制胰岛细胞凋亡，保护胰岛β细胞，减轻其糖尿病症状[36-37]。这与本研究结果相符。

因此，金银花黄酮提取物具有良好的降血糖活性，并能够改善T1DM小鼠异常脂代谢、炎症以及肝脏损伤。该研究可为金银花黄酮的开发与利用提供新的思路，但其对糖尿病的治疗机制研究还较为浅显，后续可对金银花黄酮提取物的降血糖机制进行进一步深入研究。