铁皮石斛多糖分离纯化及其药理活性研究进展

张 霞，白月明，谢雪勤，孟 达，车彦云，赵 毅

（云南省药食同源饮品工程研究中心，云南中医药大学，云南昆明 650500）

取法、微波辅助提取法、酶辅助提法、超高压提取法、闪式提取法等方法提取获得[6]。铁皮石斛粗多糖经过去除脂质、色素、单糖、低聚糖、淀粉、蛋白质等杂质，再由凝胶过滤柱色谱法、离子交换色谱法等分离纯化得到均一的铁皮石斛多糖片段。目前对铁皮石斛多糖结构的研究主要集中在多糖的相对分子质量、单糖的组成及比例、单糖的连接方式、糖苷键类型及重复单位等。

近年来，随着铁皮石斛多糖及其药理活性的深入研究，越来越多的研究围绕铁皮石斛多糖的结构特征，药理活性及机制，保健品开发应用等方面展开。基于此，本文对铁皮石斛多糖的分离纯化及相关药理作用及其机制研究进展进行综述，以期为铁皮石斛多糖的开发及应用提供参考。

1 铁皮石斛多糖的分离纯化

实现铁皮石斛多糖的有效提取和分离纯化，是铁皮石斛多糖结构和药理活性深入研究的基础。在铁皮石斛多糖分离纯化中，影响铁皮石斛多糖含量及纯度的主要杂质有色素、单糖、低聚糖、淀粉和蛋白质等[7]。谭青云等[8]以多糖损失率和色素去除率为指标，以活性炭、过氧化氢及大孔树脂对铁皮石斛多糖脱色方法进行评估，结果表明大孔树脂D4020可有效去除多糖色素并有效保留多糖含量，其色素去除率和多糖保留率分别为93.3%和85.3%。将铁皮石斛粗多糖溶液置于一定截留分子量的透析袋中在蒸馏水中透析即可除去糖、低聚糖等小分子杂质[9]。α-淀粉酶处理可有效去除铁皮石斛粗多糖中的淀粉[10]。蛋白质对铁皮石斛多糖的结构特征研究及生物活性探究造成较大干扰，因此，除去粗多糖中蛋白质是多糖分离纯化关键。除去粗多糖中蛋白质的常用方法主要有Sevag法、酶法、三氯乙酸法和盐酸法，为了提高蛋白质的去除率，也可将常用方法联合使用。目前，冻融法、树脂吸附法、醋酸铅法、双醛纤维素法、磁性壳聚糖微球法氯化钙法等绿色新型除蛋白方法也被广泛应用[11]。为探究铁皮石斛多糖的单糖组成、分子质量、连接方式等结构特征，应对铁皮石斛粗多糖进一步分离纯化。常用的分离纯化方法有凝胶过滤柱色谱法、离子交换树脂法、膜分离法、分步沉淀及盐析纯化法、化学沉淀法和电泳法（制备型区域电泳）等。

铁皮石斛多糖含量受种源、栽培条件、采收时期、干燥方法、提取方法等的影响。相关性分析表明，不同种源地的铁皮石斛茎粗与多糖含量呈显著负相关；低海拔地区栽培的铁皮石斛多糖含量明显高于中、高地区栽培的铁皮石斛，大棚栽培的铁皮石斛多糖含量高于附树和附石栽培；铁皮石斛的最佳种植年限为3年，最佳采收期为种植头年10月至翌年3月；真空冷冻干燥、微波干燥的铁皮石斛多糖含量高于传统干燥；冻融法提取和酶法提取的多糖含量高于传统水提，提取多糖含量受水料比、提取时间、提取温度、提取次数等的影响[12]。铁皮石斛多糖分子具有生物大分子的结构特征，分子质量分布广，从几百到上百万不等，单糖组成及连接方式多样，空间结构复杂。孙恒等[13]、张明泽等[14]、奚航献等[15]对2010～2019年间分离得到的铁皮石斛多糖结构特征进行了初步总结，本文在此基础上，总结了近10年铁皮石斛多糖的提取、分离纯化方法及结构特征等（表1）。铁皮石斛多糖主要由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、果糖和岩藻糖组成，也有少量分离纯化得到的多糖中含有葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸。多糖分子量及单糖组成与铁皮石斛多糖的提取、分离纯化方法相关。如分别由水提法和纤维素酶辅助法提取后分离纯化的多糖的单糖组成不同[23,33]；铁皮石斛粗多糖经DEAE-52纤维素分离柱分别用水和不同浓度的氯化钠溶液洗脱，分别得到水溶性多糖和盐溶性多糖，分子量和单糖组成比例均不相同[25-26]；分离纯化得到的铁皮石斛多糖经β-1,4-甘露聚糖内切酶水解得到酶解多糖片段，分子量由十万级变为几百，单糖摩尔比也发生了改变[41]。目前对铁皮石斛多糖的分离纯化重复性较差，一般使用多种方法联合使用，对结构的分析也仅限于对初级结构的探究。

表1 铁皮石斛多糖的提取、纯化及结构特征Table 1 Extraction, purification and structural characteristics of polysaccharides from Dendrobium officinale

2 铁皮石斛多糖的药理作用

铁皮石斛多糖具有抗氧化、降血糖、降血脂、降血压、抗疲劳、护肝等多种药理作用，近年来对改善糖尿病并发症、保护胃粘膜损伤、抗肿瘤、调节肠道微生态的药理机制的研究增多，本文主要对此进行总结归纳。不同结构的铁皮石斛多糖的生物活性有较大差异，如刘袆帆等[48]总结葡萄糖为有无抗氧化活性影响最大的单糖，具有降血糖药理活性的石斛多糖中都存在葡萄糖及甘露糖，且两种单糖以其中一种为主干。同一粗铁皮石斛多糖分级纯化得到的多糖，分子量较小的调节免疫活性较强[34]。

2.1 降血糖及改善糖尿病并发症

研究发现，DOP可有效降低血糖及改善相关并发症[49]，其机制主要有：a. 恢复胰腺损伤并促进胰岛素分泌；b. 提高胰岛素敏感度；c. 清除自由基；d. 调节肠道中酶的活性等（图1、表2）。葡萄糖和甘露糖是具有降血糖功能的DOP中存在的两个重要单糖，且具有降血糖活性的DOP中甘露糖比例高于葡萄糖[30,42,44]，但DOP的分子量及单糖连接方式与降血糖的关系还需进一步研究。

表2 铁皮石斛多糖的降血糖、改善相关并发症作用及机制Table 2 Effects and mechanisms for hypoglycemic and diabetes complication of polysaccharides from Dendrobium officinale

2.2 保护胃粘膜损伤

铁皮石斛在中医用药中常作为“肠胃药”，《神农本草经》中记载“久服厚肠胃，轻身延年”，《本草再新》中记载“理胃气，清胃火”。胃粘膜损伤是机体为抵抗物理因素、化学因素、细菌及其毒素等因素侵袭所发生的炎症反应，人体胃粘膜损伤主要以急慢性胃炎、胃溃疡等胃部疾病的症状体现。保护胃粘膜损伤模型主要体现为胃粘膜上皮细胞增殖与凋亡失衡、胃粘膜保护因子如前列腺素、NO减少、胃酸和胃蛋白酶分泌失衡、炎症因子增加、胃粘膜局部组织缺血等。研究表明以多糖为主的铁皮石斛粗提物对各种模型的胃粘膜损伤均具有恢复损伤及保护的作用[54-59]，其保护胃粘膜损伤机制主要包括：平衡胃粘膜上皮细胞增殖与凋亡；下调相关炎症因子及mRNA的表达；提高抗氧化活性逆转胃粘膜损伤（图2、表3）。

图2 铁皮石斛多糖保护胃粘膜损伤的作用机制示意图Fig.2 Schematic on protection of gastric mucosal injury mechanisms of polysaccharides from Dendrobium officinale

续表 1

2.3 抗肿瘤

体外实验研究表明，铁皮石斛多糖粗提物具有抗宫颈癌、肝癌、结直肠癌、结肠癌、淋巴瘤等活性[60]，其作用与促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞自噬、增强机体免疫等有关（图3、表4）。粗提物中可能还含有联苄类、菲类、生物碱等具有抗肿瘤作用的活性成分，限制了DOP抗肿瘤机制的深入研究，因此纯化分离DOP对铁皮石斛的抗肿瘤研究具有重要意义。

表4 铁皮石斛多糖的抗肿瘤作用及机制Table 4 Treatments and mechanisms for anti-tumor of polysaccharides from Dendrobium officinale

图3 铁皮石斛多糖抗肿瘤的作用机制示意图Fig.3 Schematic on anti-tumor mechanisms of polysaccharides from Dendrobium officinale

2.4 调节肠道微生态

肠道微生物群影响人体营养物质吸收、转化、代谢与合成；形成生物屏障，阻止致病菌入侵；作为抗原，刺激宿主产生抗体，增强免疫力[65]。肠肝轴理论、肠胃轴理论、肠脑轴理论和肠肾轴理论都揭示了脏器疾病的发生会导致肠道微生态失衡，肠道微生态的失衡也会影响脏器疾病的发生[66]。

铁皮石斛多糖调节肠道微生态的作用主要有:a.调整肠道微生态结构：铁皮石斛多糖对乳酸菌、双歧杆菌由明显的增殖作用，对大肠杆菌有一定的抑制作用；b.调节肠道酶活性：铁皮石斛能够调节肠道中蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶的活性，改善脾虚便秘症状。研究表明，给与正常小鼠铁皮石斛多糖后，小鼠的脾脏系数、胸腺系数、真菌和双歧杆菌菌落计数均升高；细菌和大肠肝菌的菌落计数降低；淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶和纤维素酶活性均升高，改善了小鼠的肠道功能[66]。

2.5 其他

铁皮石斛多糖作为天然的外源性抗氧化剂，不仅能直接清除自由基，又可提高机体内抗氧化酶活力，表现出很好的抗氧化力，减轻自由基对机体的损伤[20]。娄潇琳[67]发现铁皮石斛多糖可对小鼠T盒子转录因子（T-box transcription factor，T-bet）和GATA连接蛋白3（GATA binding protein 3，GATA-3）的表达以及干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和IL-4的分泌起促进作用，可提高机体整体的免疫能力。铁皮石斛多糖可以预防与保护由顺铂造成的雄性小鼠生殖系统损伤，有效促进生殖系统的损伤恢复[68]。铁皮石斛多糖还可通过减少细胞内脂质过氧化物的产生的及清除活性氧对缺氧/复氧的H9c2细胞起到较好的保护作用[69]。

3 总结与展望

近年来，铁皮石斛广泛应用于保健食品的开发，以铁皮石斛为主原料的保健食品类型主要有片剂、胶囊、口服液、饮品、冲剂、含片、浸膏等，但其功效较单一，以增强免疫力及缓解体力疲劳为主。基于铁皮石斛多糖具有降血糖及调节肠道微生态等作用，未来有望将铁皮石斛开发成具有调节血糖、改善肠道消化功能、控制体重的功能性食品。目前铁皮石斛开展按照传统既是食品又是中药材的物质生产经营试点工作，其产品逐渐呈现多元化的趋势，发酵酒、饼干、发酵饮料等食品研究领域均有应用。

但整体而言，铁皮石斛开发仍旧处于较低水平，分析其原因：a. 受种源、栽培条件、采收季节、提取方法、分离纯化方法等的影响，铁皮石斛多糖分离纯化的重复性较差，目前主要对其初级结构进行研究；b. 多糖结构不够清晰，限制了生物活性与结构关系的深入探究；c. 市场上的铁皮石斛来源复杂，优劣混杂，地方标准不适用于不同来源的铁皮石斛，目前暂无一个可适用于铁皮石斛食品开发的国家标准，导致相关产品开发受到制约；d. 精深加工技术水平较低，产品开发相对单一，未能打造知名品牌产品。基于以上存在的问题，在未来的研究中，应进一步优化铁皮石斛多糖分离纯化的方法及技术，完善结构分析方法，使其结构特征更清晰化，为探究铁皮石斛多糖结构与其生物活性之间的关系提供有效依据；加强铁皮石斛原料市场的监管，抵制以假乱真，以次充好的市场现状，制定相关标准；加大创新力度，使用现代高新技术开发精深加工产品，保证产品具有独特优势，提高铁皮石斛的附加值。