紫外法和皮粉法测定塔拉单宁含量的对比研究

汤丽华， 张亮亮, 张 禾

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；江苏省生物质能源与材料重点实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042)

单宁在制药、生化、日化、食品以及精细化工等高科技领域具有广阔的应用前景，市场上供不应求[1-3]。目前市场上的单宁产品主要有五倍子单宁、塔拉单宁、栗木单宁等[4-5]。我国是五倍子单宁主要生产国，五倍子对生长环境有一定的条件要求，主要种植于我国的西南方[6]。塔拉单宁与五倍子单宁同属于没食子单宁，主要存在于塔拉果荚中，塔拉粉含单宁50%左右[7-8]。目前，我国每年可供加工利用的五倍子原料在9 000吨左右，而从秘鲁等南美国家进口的塔拉粉产品超过2万吨/年，塔拉粉已超过五倍子成为植物单宁加工的主要原料。塔拉树生命力顽强，对生长条件要求没有五倍子高，种植范围广，产量大，塔拉单宁与五倍子单宁有相似的结构，工业上可被用来替代五倍子作为生产没食子酸、单宁酸等产品的原料[9-11]。

单宁酸检测方法很多，有皮粉法、紫外分光光度法、高效液相法、气相色谱法等[12]。而不同的检测方法对不同的单宁酸产品的灵敏度和稳定性存在一定的差异性。高效液相法与气相色谱法虽可检测单宁酸，但至今没有完善的国家标准，测定不同单宁酸产品时，需要对流动相、配比、流速、柱温等条件进行相应的选择。紫外法(LY/T 1642—2005，GB/T 27985—2011)与皮粉法(LY/T 1082—2008)虽有行业标准，但主要适用于五倍子单宁。由于目前塔拉单宁分析没有统一的行业标准和国家标准，大多数企业采用紫外法对塔拉单宁含量进行测定，但由于塔拉单宁与五倍子单宁在化学结构上存在一定的差异，利用紫外法测定塔拉单宁含量所得数值普遍偏低；而皮粉法测定操作耗时比较长，步骤非常繁琐，对实验人员要求较高[13-15]。因此，本研究对5种不同含量的塔拉单宁分别用紫外法与皮粉法进行单宁含量测定，并进行对比研究，获得紫外法测定塔拉单宁含量计算公式中的矫正常数，以期为制定紫外法测定塔拉单宁分析试验方法提供依据。

1 实 验

1.1 材料试剂与仪器

塔拉单宁样品：本实验室自行制备高纯度塔拉单宁样品记为T1；五峰赤诚生物科技股份有限公司提供样品记为T2、T3；张家界久瑞生物科技有限公司提供样品记为T4；四川亭江新材料股份有限公司提供样品记为T5。五倍子单宁酸标样(纯度≥99%)、铬皮粉(吸收单宁能力≥0.060 g/g)，均由实验室自行制备，所用水为一级水，其余试剂均为市售分析纯。

UV/VIS Agilent Technologies carry 8454型紫外-可见分光光度计，美国安捷伦公司；LC-20A液相色谱仪，日本岛津公司。

1.2 塔拉单宁含量测定

1.2.1紫外法 依据《单宁酸分析试验方法》(LY/T 1642—2005)[16]进行紫外法分析试样中单宁含量，实验中做平行样，误差≤0.7%，取平均值。单宁酸(X1)计算公式如下：

(1)

式中：X1—紫外法测塔拉单宁中单宁酸质量分数，%;A0—塔拉单宁样品溶液的吸光度；A1—单宁酸标准样品溶液的吸光度；A2—经铬皮粉吸附后塔拉单宁溶液的吸光度；m1—单宁酸标准品质量，g；m0—塔拉单宁质量，g。

1.2.2皮粉法 依据《栲胶分析试验方法》(LY/T 1082—2008)[17]进行皮粉法分析试样中单宁含量，实验中做平行样，当单宁的量≥33%，且重复实验结果误差≤1.0%，取平均值。单宁酸(X2)计算公式如下：

(2)

式中： 20—定容体积与取样体积的比值；X2—皮粉法测塔拉单宁中单宁酸质量分数，%； 1.2—稀释液与原液的体积比值；m2—可溶物质量，g；m3—50 mL可溶物中非单宁质量，g；m4—铬皮粉空白残渣质量，g；m0—塔拉单宁的质量，g；w0—塔拉单宁含水量，%； 0.075—铬皮粉空白试验的容许修正值，g/L。

1.3 结构表征

1.3.1紫外-可见吸收光谱分析 分别将塔拉单宁T1与五倍子单宁溶解于甲醇中，均配成质量浓度为1 g/L 的甲醇溶液。选择T1是因为它纯度高，更为准确。利用紫外-可见分光光度计在波长200～450 nm范围内进行紫外光谱扫描。

1.3.2HPLC分析 色谱条件：色谱柱ODS C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流动相为A-B混合液，其中，A为甲醇(含0.1%三氟乙酸)，B为水(含0.1%三氟乙酸)。梯度洗脱：0～3 min, 10%A，90%B；3～25 min, 10%～30%A,90%～70%B；25～50 min, 30%～80%A,70%～20%B；50～55 min, 80%～10%A,20%～90%B；55～60 min, 10%A,90%B。流速：1.0 mL/min；测试液质量浓度：1 g/L(溶于甲醇)；检测波长：280 nm；色谱柱温度：28～32 ℃；进样量：5～15 μL。

1.4 数据处理

试验均重复进行3次，结果采用平均值±标准差表示。数据分析通过SPSS软件完成，利用One-way ANOVA方法进行显著性检验。

2 结果与讨论

2.1 紫外法和皮粉法测定塔拉单宁含量对比分析

紫外法和皮粉法测定5种塔拉单宁含量的对比分析见表1。从表1可知，利用One-way ANOVA方法对单宁含量结果数值的显著性检测发现：高纯度的塔拉单宁(93%)用紫外法和皮粉法检测结果并无显著性差异(P>0.05)，而纯度60%左右的塔拉单宁在两种方法中存在显著性差异(P<0.05)，出现这两种不同的现象可能是因为含60%的塔拉单宁不仅含有单宁，还含有其它多糖等杂质，这些杂质也可以与蛋白质进行结合，加大了络合前后的质量差，而皮粉法主要就是利用重量法进行测定，故导致皮粉法测量值偏高。提纯后的塔拉单宁因含多糖等杂质的量较低，所以高纯度的塔拉单宁用皮粉法和用紫外法所测得的数值偏差不大。若不考虑多糖的影响，2种方法得到的结果以皮粉法为准。

表1 紫外法和皮粉法测定5种塔拉单宁1)

由于塔拉单宁T2～T5在皮粉法和紫外法中存在显著性差异，故对这4种塔拉单宁在2种测量方法下的数值进行对比分析，经计算机软件SPSS计算可得皮粉法测定数值是紫外法测定数值的1.03倍，得出皮粉法和紫外法测定4种样品的平均值分别为62.213%±2.519%、 60.475%±2.691%，故而计算出紫外法测定塔拉单宁含量计算公式中的矫正常数p为1.03。即得到利用紫外法测定塔拉单宁含量矫正计算公式(式(3))：

(3)

式中：w1—试样干燥损失的质量分数，%； 1.03—矫正常数。

2.2 结构表征

2.2.1紫外-可见吸收光谱分析 分别用甲醇配制1 g/L的T1塔拉单宁与五倍子单宁溶液，进行紫外光检测。塔拉单宁与五倍子单宁的紫外-可见吸收光谱见图1。从图可以看出，在紫外-可见吸收光谱中塔拉单宁T1与五倍子单宁的最大吸收峰均为276 nm，这是由于塔拉单宁与五倍子单宁结构上存在类似的多酚结构，在276 nm处具有特定的紫外吸收。这也是紫外法测定塔拉单宁含量将紫外分光光度计波长设置在276 nm处的原因。此外，由图1可知，同浓度下的塔拉单宁在276 nm处的吸收峰比五倍子单宁的吸收峰要高，该位置的吸收峰主要受苯环影响，HPLC谱图(图2)中可明显看到五倍子单宁主体出峰位置靠后，这说明五倍子单宁的平均分子质量要比塔拉单宁的平均分子质量大，也就是说相同质量浓度下所含的塔拉单宁的分子个数要比五倍子单宁的分子个数多。因此，在相同质量浓度时塔拉单宁所含的苯环的数量更多，塔拉单宁的吸光度比五倍子单宁的吸光度要高。

图1 单宁的紫外-可见吸收光谱Fig.1 The UV-Vis absorption spectra of tannin

2.2.2HPLC分析 5种塔拉单宁与五倍子单宁的HPLC谱图见图2。从图2可知，在1.3.2节色谱条件下，塔拉单宁成分出峰时间主要在20～40 min，而五倍子单宁成分出峰时间主要在30～45 min。导致这一现象的主要原因是塔拉单宁与五倍子单宁在化学结构上存在一定的差异，塔拉单宁分子主要是由奎宁酸通过酯键连接没食子酸构成，而五倍子单宁分子则是由葡萄糖通过酯键连接没食子酸构成[18]。

塔拉单宁tara tannin: a.T1; b.T2; c.T3; d.T4; e.T5; f.五倍子单宁Chinese gallnut tannin

3 结 论

3.1采用紫外法和皮粉法对5种塔拉单宁进行对比分析，并用One-way ANOVA方法进行显著性检验分析，结果表明：高纯度的塔拉单宁(93%)在2种测试方法中无显著差异(P>0.05)，而纯度60%左右的4种塔拉单宁在2种测试方法间存在显著性差异(P<0.05)，塔拉单宁的测定结果以皮粉法为准，通过SPSS软件可计算出紫外法测定塔拉单宁含量计算公式中的矫正常数p为1.03。

3.2紫外-可见吸收光谱分析表明：塔拉单宁和五倍子单宁的最大吸收峰均为276 nm，同质量浓度下塔拉单宁的吸收峰强度高于五倍子单宁。HPLC分析表明：塔拉单宁成分出峰时间主要在20～40 min，而五倍子单宁成分出峰时间主要在30～45 min。