超声辅助提取裕丹参总黄酮工艺的优化

◎ 倪帆呈，江喜梅，李金贵，杨双旭，周炎花

（1.漳州科技职业学院，福建 漳浦 363200；2.南京融点食品科技有限公司，江苏 南京 211399）

丹参，是指唇形科的多年生草本丹参（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根茎或根。丹参酮、丹参素、丹酚酸、维生素E[1-2]、黄酮类和异黄酮类等化合物均为其主要的活性成分。其中，黄酮具有抗肿瘤、消炎、降血脂、保护神经和抗高血脂等药理作用[3-6]。当前，常见的黄酮提取方法有酶辅助提取、溶剂浸提法、高速剪切法、回流提取法、超临萃取法、超声提取法、发酵法和微波辅助法[7-10]等。

裕丹参享有“丹参之首”的美称，是地理标志产品（GB/T 22745—2008）。目前研究主要集中于其最主要的两个成分丹参酚酸和丹参酮[11-12]等，总黄酮的研究较少。本文以裕丹参根为主要原材料，采用超声波辅助提取黄酮类化合物，以期通过本研究，为促进丹参经济价值提升及后续相关研究提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

裕丹参购于河南省方城县中药公司；95%乙醇；AlCl3（上海试剂四厂）；KAc（国药集团化学试剂有限公司）；芦丁等化学试剂均为分析纯。

JA3003A分析天平（上海精天电子仪器有限公司）；V-1600可见分光光度仪（上海美谱达仪器有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品处理方法

参考文献[13-14]方法，将裕丹参根粉碎，称取其粗粉2 g，置于锥形瓶中，加入适量一定浓度的乙醇溶液，混匀。置于一定温度下恒温水浴，冷凝回流，经一定提取时间，趁热减压抽滤。将合并提取液置于100 mL容量瓶，用与提取时相同浓度的乙醇溶液定容，作待测液备用。

1.2.2 总黄酮含量的测定方法

（1）芦丁标准曲线的绘制。通过查阅相关文献[15]，采用AlCl3-KAc法测定总黄酮含量。称取0.011 g芦丁，用95%乙醇定容至50 mL，作为标准液。再取20 mL标准液，95%乙醇定容至100 mL，作工作液。分别取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL工作液于50 mL容量瓶中，分别向瓶中加2 mL 2.5% AlCl3和9.82% KAc摇匀，30%乙醇定容，静置30 min于415 nm下测量吸光值。以浓度C（mg·mL-1）为纵坐标，以吸光度A为横坐标绘制标准曲线，得回归方程C=1.263 6A+0.000 9，R2=0.999 8（n=6）。

（2）裕丹参根黄酮水分含量的测定。参照《中国药典》（2020版）通则0832第二法进行。以减失的裕丹参重量为根据，计算其粗粉含水量（%）。

（3）黄酮的提取与测定。取1 mL提取液至50 mL容量瓶中，参照（1）方法测溶液吸光度，对照回归方程得到黄酮的浓度。裕丹参根黄酮的提取率计算公式为

式中：C为总黄酮浓度，mg·mL-1；V为样品提取液第一次定容的体积，mL；X为稀释倍数；m为样品干重，g。

1.3 黄酮提取工艺的实验设计

1.3.1 单因素实验设计

传统的水煎煮法提取黄酮存在提取时间过长、产品易腐败等缺点[16]。本法采用乙醇作为溶剂，在此基础上采用超声波辅助提取黄酮，将温度、料液比、提取时间、乙醇浓度4个因素作为考察对象，其中超声波功率为250 W，各因素的考察范围如表1所示。

表1 超声波提取法单因素实验各因素的考察范围列表

1.3.2 正交设计实验设计

在单因素实验基础上，系统考察提取温度、料液比、提取时间、乙醇浓度对裕丹参根黄酮提取率的影响，实验因素水平如表2所示。

表2 因素水平表

2 结果与分析

2.1 裕丹参粗粉的水分含量

根据1.2.2的方法进行实验，测得裕丹参粗粉的水分含量为9.918%。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 温度对裕丹参根黄酮提取率的影响

由图1可知，当提取温度低于60 ℃时，黄酮提取率呈上升趋势，这可能是温度升高致使裕丹参根黄酮溶解，进而提取率增加[17]。但当提取温度超过60 ℃后，黄酮提取率开始下降。这可能是过高的温度使部分对温度变化比较敏感的黄酮类物质，如酚式结构类被破坏，提取率下降[18]。当提取温度为60 ℃时，黄酮提取率最高。故最适宜提取温度为60 ℃。

图1 提取温度对丹参根黄酮得率的影响图

2.2.2 料液比对裕丹参根黄酮提取率的影响

由图2可知，料液比（g∶mL）在1∶20时，裕丹参根黄酮提取率达到最大，后随料液比的增大而呈下降趋势。一定范围内，料液比的增加会促进黄酮物质的溶解，后随着料液比的增加，则会出现杂质增加、黄酮类物质的极性发生改变和结构被破坏等情况，从而引起提取率的降低[19]。故料液比为1∶20时较为适宜。

图2 料液比对裕丹参根黄酮得率的影响图

2.2.3 提取时间对裕丹参根黄酮提取率的影响

由图3可知，提取时间小于40 min时提取率无明显的增加，在提取时间为50 min时提取率最低且提取时间的延长可能会破坏部分黄酮类物质结构。出于时间和能效因素考虑，将提取时间定为20 min为宜。

图3 提取时间对裕丹参根黄酮得率的影响图

2.2.4 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

由图4可知，丹参黄酮提取率整体上波动较小。在乙醇浓度为70%时，提取率达到最大；大于70%时，提取率出现一定的下降。黄酮类物质的组分及其性质对提取率有一定的影响，如在热水中黄酮苷类溶解度高，在醇等溶剂中黄酮苷元溶解度高[20]。另外，溶剂的极性对黄酮的提取效率也有一定的影响[21]。由结果看来，整体影响较小，故出于成本因素考虑，将乙醇浓度定为50%较为适宜。

图4 乙醇浓度对裕丹参根黄酮得率的影响图

2.3 正交实验结果与分析

由表3和表4可知，影响裕丹参根黄酮得率因素的主次顺序为料液比＞提取温度＞提取时间＞乙醇浓度，其中料液比对结果有显著影响（P＜0.05）。最佳组合为A1B1C3D3，由于乙醇浓度对结果影响不显著，出于节约材料考虑，故最终选取工艺为A1B1C3D1，即料液比（g∶mL）为1∶10，提取温度为50 ℃，提取时间为40 min，乙醇浓度为50%。以此最佳条件下，提取率达到4.81%。

表3 正交实验结果表

表4 方差分析表

3 结论

（1）以超声辅助提取裕丹参根总黄酮方案是可行的。料液比在4个考察因素中（提取温度、料液比、提取时间和乙醇浓度）料液比对结果的影响最大。不同因素对其提取率影响大小可能与此类黄酮的结构和极性有一定的关系，需进一步进行验证与研究。

（2）以黄酮得率为指标，通过单因素与正交实验确定提取裕丹参根黄酮的最佳工艺为料液比1∶10、提取温度50 ℃、提取时间40 min、乙醇浓度50%，其黄酮提取率达到4.81%。

（3）在提取裕丹参根黄酮方面，超声辅助提取法较水煎煮法具有用时更短、提取效率高、节省样品等优点。