衢州主要柑桔青果果皮6种黄酮类化合物含量变化和差异研究

吴 群，孙建城，张姬雯，程慧林

(1 衢州市农业林业科学研究院，浙江衢州，324000； 2 衢州市农业特色产业发展中心，浙江衢州，324000)

黄酮类化合物是植物次级代谢产物中一种分子量较低的多酚类物质，在自然界多种植物中广泛存在，主要分布于植物的根、茎、叶、花、种子等部位，在各种蔬菜、水果和谷物中含量丰富[1]。许多研究证明，黄酮类化合物作为一种高效和副作用小的抗氧化剂，在抗癌、抗病毒、抗炎、抑制血小板凝集以及改善血管脆性等方面具有良好的生理功能[2-3]。迄今已从柑桔中鉴定出250多种黄酮类化合物[4]。根据黄酮类化合物的基本结构、官能团种类及位置，柑桔中的黄酮类化合物主要有以下7类：黄烷酮、黄酮、黄酮醇、黄烷醇、多甲氧基黄酮、异黄酮和花色苷[5]。柑桔果皮中富含的胡萝卜素、精油、果胶、黄酮类化合物、柠檬苦素等生物活性物质，具有抗氧化[6]、抗过敏[7]、抗炎[8]、抗癌[9-10]、降血压[11]、降血脂[11-12]等生物活性。柑桔含有丰富的酚类物质，果皮中酚类物质的含量比果肉多，果皮中黄酮类化合物的含量比种子多[13]；黄酮/黄酮醇含量最高的部位是叶，其次是外果皮[14]。目前对成熟胡柚果实的黄酮类化合物等生物活性物质的研究报道[15-17]已有不少。利用常山胡柚小青果已经开发出中药饮片[18]，利用胡柚、椪柑、日本加工型香橙的青果挖除果肉烘干制成的桔胎茶产品比较受市场欢迎，但对这3种青果的最佳采摘期和黄酮类化合物变化研究不多。通过研究椪柑、胡柚和新发展的加工用香橙3种柑桔青果黄酮类物质的变化和差异，对青果的加工利用有较大指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料在衢州市衢江区莲花镇十里丰农场统一管理的柑桔园，选香橙(Citrusjunos)、胡柚(Ciritusparadisi‘Changshanhuyou’)、椪柑(Critusreticulata‘Ponkan’)第二次生理落果结束后不同时期的青果，即从2021年7月26日到8月23日(幼果膨大期)每隔7 d从选定的植株上采果(果实横径在35～60 mm之间)。每个品种选3株树，每株树每次采10个果，要求随机选取无明显病虫斑、大小均匀的果实，对半横切，挖除囊衣和果肉部分，留下果皮部分待测。

1.2 仪器与主要试剂仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪，Compass C18(2)反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，超声波清洗器，湘仪高速冷冻离心机，旋涡混合器。试剂：芸香柚皮苷(CAS：14259-46-2)、橙皮苷(CAS：520-26-3)、新橙皮苷(CAS：13241-33-3)、甜橙黄酮(CAS：2306-27-6)、川皮苷(CAS：478-01-3)和芦丁(CAS：153-18-4)标准品(源叶，纯度≥98%)，HPLC级乙腈(OCEANPAK，纯度≥99.9%)，HPLC级甲醇(OCEANPAK，纯度≥99.9%)，磷酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，≥85.0%)，盐酸(国药集团化学试剂有限公司，优级纯，36.0%～38.0%)，超纯水。

1.3 检测方法样品前处理操作。芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川皮苷样液制备：称取约2 g果皮样本，加入10 mL 80%甲醇水溶液，研磨成浆，超声1 h后过夜浸提，离心取上清，过滤器过滤后待测。芦丁(又称芸香苷)样液制备：称取约0.2 g果皮样本，加入1.5 mL甲醇-盐酸混合液(V甲醇∶V25%盐酸=4∶1)研磨成浆后转入EP管中，80 ℃水解1 h，超声1 h，离心取上清液，定容至1.5 mL，过滤器过滤后待测。

液相色谱分析条件：Agilent1100高效液相色谱仪，波长为287 nm(检测芦丁波长为360 nm)。Compass C18(2)反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。柱温为30 ℃。流速为0.8 mL/min。进样体积为10 μL。流动相A为0.1%磷酸水溶液，B为乙腈，按表1进行梯度洗脱(检测芦丁时，VA∶VB=80∶20)。

表1 流动相梯度洗脱时间和比例(体积比)

1.4 标准曲线测定精确称取芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川皮苷和芦丁标准品，用甲醇溶解，配置成不同质量浓度的标准溶液。按上述色谱条件，依次检测各标准溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，计算得到芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川皮苷、芦丁的标准曲线方程，线性范围与相关系数。

1.5 数据分析通过各物质的标准曲线方程将样品液测得的色谱峰面积转换为质量浓度，再根据样品制备样品液过程中稀释倍数关系求得样品中各物质含量。采用SAS软件进行差异显著性(α=0.05)和极显著性(α=0.01)检验分析，检验方法为邓肯氏新复极差法。

2 结果与分析

2.1 6种黄酮类化合物的标准曲线在本试验条件下，芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川皮苷、芦丁的标准曲线方程，线性范围与相关系数见表2。

表2 检测物质的标准曲线方程、线性范围和保留时间

2.2 不同采摘期椪柑青果皮6种黄酮类化合物含量变化在7月26日至8月23日期间，芸香柚皮苷含量先短期(7月26日至8月2日)上升，此后基本不变。8月16日，橙皮苷含量(859.45 μg/g)和芦丁含量(46.02 μg/g)达到最高值。8月9日，新橙皮苷含量(36.84 μg/g)、甜橙黄酮含量(1 371.27 μg/g)和川皮苷含量(7 035.90 μg/g)达到最高值。总体上，椪柑青果黄酮类化合物含量在8月9日至8月16日达高峰(见表3)。

表3 不同采摘期椪柑青果皮6种黄酮类化合物含量变化 μg/g

2.3 不同采摘期胡柚青果皮6种黄酮类化合物含量变化在7月26日至8月23日期间，芸香柚皮苷和橙皮苷含量呈下降趋势。新橙皮苷含量在8月2日后呈下降趋势。甜橙黄酮和川皮苷含量先升后降再略升，在8月9日达到最高。芦丁含量则逐渐升高。总体上，芸香柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量在7月下旬至8月初较高；甜橙黄酮和川皮苷含量在8月上旬较高，芦丁含量随果实膨大而一直增加(见表4)。

表4 不同采摘期胡柚青果皮6种黄酮类化合物含量变化 μg/g

2.4 不同采摘期香橙青果皮6种黄酮类化合物含量变化在7月26日至8月16日期间，芸香柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量持续下降，8月23日又有所回升，以7月26日的含量最高。甜橙黄酮和川皮苷含量先降后升，含量最低值分别出现在8月2日和8月9日。芦丁含量随果实膨大而升高，且从7月26日到8月2日变化幅度大(见表5)。

表5 不同采摘期香橙青果皮6种黄酮类化合物含量变化 μg/g

2.5 相同时期不同柑桔青果皮黄酮类化合物含量差异选取8月9日样品进行对比的结果表明，不同柑桔品种青果间黄酮类化合物含量存在较大差异。同期，香橙青果皮的芸香柚皮苷、橙皮苷和芦丁含量高，与椪柑和胡柚都有极显著差异；胡柚青果皮的新橙皮苷含量最高，与香橙、椪柑有极显著差异，其中，椪柑青果皮的新橙皮苷含量很低；椪柑青果的甜橙黄酮和川皮苷含量高，与胡柚和香橙有极显著差异(见表6)。

表6 椪柑、胡柚、香橙青果皮6种黄酮类化合物含量对比 μg/g

3 讨论与结论

衢州是浙江省重点柑桔产区，以椪柑和胡柚等为主栽品种。近几年随着全国柑桔产业的发展，晚熟柑桔沃柑和春见等发展迅速。由于与这些品种的销售期重叠，衢州椪柑的贮藏优势丧失，春节后市场受到严重冲击[19]。为了应对市场变化，衢州柑桔产业加快转型力度，柑桔加工产业逐渐成熟，青果也逐步被开发利用。衢州地区有明显的梅雨期，梅雨期结束进入高温干旱少雨的时期，这与幼果的膨大期基本一致。郑雪良等[20]在胡柚小青果的黄酮类化合物含量和抗氧化活性的研究中指出，胡柚小青果的黄酮类化合物绝大部分以黄烷酮糖苷形式存在，主要为柚皮苷，其次为新橙皮苷，还含有芸香柚皮苷等。胡柚富含黄酮类化合物、柠檬苦素等生物活性物质，有清除自由基、提高人体免疫力、抗菌、消炎以及预防肿瘤的功效[21]，胡柚果皮中的黄酮类化合物含量也非常可观，胡柚果皮粗提物清除自由基的能力并不比黄酮类化合物单体弱，有的甚至强于单体化合物[16]。目前，国内柑桔青果皮利用较为成功的案例是广东利用茶枝柑青果皮加工成柑普茶。在广东，5—9月茶枝柑果皮中的总黄酮含量随着采收期的延迟而逐渐下降，以5月的含量最高，12月成熟时含量最低，说明随着成熟度的增加总黄酮成分发生了转化或者总黄酮成分的积累速度低于果皮质量的积累速度，以致总黄酮的相对含量呈降低趋势[22]。同一品种，不同采收期黄酮类化合物含量变化差异较大[23]。不同柑桔品种，同一采收期青果的黄类酮化合物含量对青果加工也有较大影响。

本研究表明，第二次生理落果后，胡柚、椪柑、香橙青果(幼果)果皮的6种黄酮类化合物含量随着膨大过程变化而变化，增减不一。8月16日的检测数据有些异常，推测可能与前一天雨后采样有关。8月上旬(8月9日)，香橙青果皮的芸香柚皮苷、橙皮苷、芦丁含量高于椪柑和胡柚青果皮，胡柚青果皮的新橙皮苷含量高于香橙和椪柑青果皮，椪柑青果皮甜橙黄酮和川皮苷含量高于胡柚和香橙青果，因而在其加工产品也就存在口感差异。目前国内对加工用香橙青果的研究不多，通过检测椪柑、胡柚和香橙青果6种黄酮类化合物含量及变化能对今后生产利用起到一定指导意义。