奇异根串珠霉菌拮抗放线菌的筛选与鉴定

余凤玉，祝安传，2，杨德洁，宋薇薇，唐庆华，牛晓庆

(1 中国热带农业科学院椰子研究所/院士团队创新中心，海南文昌，571339；2 海南热带海洋学院，海南三亚，572022)

奇异根串珠霉Thielaviopsisparadoxa寄主范围非常广泛，包括重要经济作物，如甘蔗、海枣、香蕉、高粱、可可、红薯、椰子、菠萝、玉米和其他棕榈植物[1-5]。奇异根串珠霉菌可感染植物的任何部位，引起泻血、叶烧、心腐和芽腐等症状，不同棕榈树症状有所不同[1，6]。为害椰子引起泻血病、茎干腐烂病、芽腐病，为害海枣Phoenixdactylifera和平叶棕Howeaforsteriana、油棕Elaeisguineensis[7-8]引起茎腐病，为害椰枣引起黑色焦枯[9-10];此外，还可引起泰国酒瓶椰Hyophorbelagenicaulis[11]、槟榔Arecacatechu、Phoenixafricanus、棕竹Rhapisexcelsa、大王椰Roystonearegia、菜棕Sabalpalmetto、金山葵Syagrusromanzoffiana和华盛顿棕Washingtoniafilifera的芽腐病[12-13]，被认为是一种攻击性强、难以控制的病原菌，可通过雨水、风、昆虫、啮齿类小动物及田间活动传播[1-2，14]。生产上防治该菌引起的病害主要使用化学药剂，这不仅可能引起病原菌产生抗(耐)药性，同时也把天敌昆虫杀死，药剂飘散空气中对生态环境还会造成一定的危害，这与《海南生态省建设规划纲要》中提到的大力发展绿色农业，为人民群众提供安全放心的绿色食品的宗旨不符，急需寻找新的防治方法。利用拮抗放线菌资源是植物病害生物防治的主要途径之一，不仅无化学防治带来的副作用，还能维持生态平衡[15]。目前，奇异根串珠霉菌的生物防治主要集中在拮抗真菌资源的利用[11，16-19]，拮抗放线菌利用较少。放线菌是重要的微生物资源，与人类生活密切相关，许多新的生化药剂都是放线菌的次生代谢产物。本研究采集槟榔根际土壤进行放线菌分离，筛选对奇异根串珠霉菌有良好抑菌效果的菌株，并进行鉴定，为放线菌后续防效及应用提供支持，丰富奇异根串珠霉菌生防微生物资源。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

在海南省10个槟榔园采集土壤(见表1)，选取植株根部5～10 cm深处土壤，装入干净塑封袋中，并标明采样日期和地点等带回实验室4 ℃保存备用。

表1 海南省槟榔园土样采集地点

1.2 菌株和药剂

供试靶标菌：棕榈科植物病原真菌奇异根串珠霉菌Thielaviopsisparadoxa，来自中国热带农业科学院椰子研究所植物保护研究中心。供试药剂：50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂，拜耳作物科学公司产；750 g/L十三吗啉乳油，上海生农生化制品有限公司产。

1.3 放线菌的分离与纯化

采用平板梯度稀释法[20]，把土壤稀释液涂布在含重铬酸钾150 mg/L溶液的改良高氏1号培养基上，28 ℃人工气候箱中倒置培养10 d，重复3次。用无菌接种环挑取单菌落，将其移至改良高氏1号培养基上画线培养，转代2～3次纯化后，斜面培养保存备用。

1.4 拮抗放线菌的筛选

1.4.1 初筛 在PDA平板(直径9 cm)中央接入直径0.6 cm的奇异根串珠霉菌菌块，再以十字交叉法在边缘接入4株不同的放线菌菌饼，对照只接种奇异根串珠霉菌，在人工气候箱中28 ℃培养2 d后，以十字交叉法测量菌落大小。

1.4.2 复筛 采用菌丝生长速度法，放线菌发酵液的制备参考文献[21]。取制备好的发酵液用0.22 μm滤膜过滤后，取滤液2 mL、供试药剂分别与融化后冷却至50～60 ℃的PDA 18 mL混匀，倒入直径9 cm培养皿中制成平板，以加无菌水2 mL的PDA为对照。在平板中间接入直径0.6 cm的奇异根串珠霉菌饼，重复3次，28 ℃培养。待对照长满平板后，采用十字交叉法测量菌落大小。计算菌丝生长抑制率[22]，菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径) ×100。

1.5 拮抗放线菌鉴定

1.5.1 形态学鉴定 培养特征观察、形态鉴定及生理生化试验参照《链霉菌鉴定手册》[23]的方法进行。

1.5.2 分子鉴定 以细菌通用引物27F/1492R[24]对菌株D2-3的DNA进行PCR扩增。反应体系20 μL：2×Power Taq PCR Mastermix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O至20 μL。扩增程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性50 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后延伸8 min，10 ℃保存。扩增产物寄往生工生物工程股份有限公司测序，所得序列与GenBank数据库中的序列比对，使用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

1.6 数据统计与分析

采用SAS软件进行数据统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌筛选

从供试土壤样品中分离纯化得到放线菌120株，初筛出22株对奇异根串珠霉菌有抑菌效果，将其进行复筛；4株放线菌发酵液对奇异根串珠霉菌的菌丝生长抑制率大于90%。其中菌株D2-3抑菌率为99.76%，显著高于其他菌株的抑菌率，与50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂1 μg/mL的抑菌效果相当，显著高于750 g/L十三吗啉乳油(1 μg/mL)的抑菌效果(见表2和图1)，确定为优势拮抗菌株，并对其进行分类鉴定。

图1 放线菌D2-3等4个菌株发酵液及药剂对奇异根串珠霉菌的平板抑制作用

表2 放线菌发酵液对奇异根串珠霉菌的抑制作用

2.2 拮抗放线菌D2-3鉴定

2.2.1 形态和培养特征 在高氏1号培养基上，放线菌D2-3菌落圆形，干燥，中间隆起，不透明，边缘整齐，气生菌丝和基内菌丝开始均呈白色，慢慢变为灰白至紫灰色，后期变为黑色，无可溶性色素产生。在光学显微镜下观察发现，菌丝由中心向四周辐射生长，多为直线状，少许弯曲；气生菌丝发达，有分支，成熟后断裂，可分化出孢子丝(见图2)。

图2 放线菌菌株D2-3菌丝形态及高氏培养基上菌落形态

2.2.2 生理生化特征 放线菌D2-3不能使明胶液化，不产生淀粉酶，不能水解纤维素，不产生硫化氢；能使牛奶胨化，能还原硝酸盐；能利用天门冬氨酸、色胺酸等氮源，不能利用肌醇、甘露醇、精氨酸等氮源；供试的葡萄糖、鼠李糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖等碳源均不能利用。

2.2.3 16S rNDA序列分析 经测序，放线菌D2-3的核酸序列长度为1 024 bp(GenBank登录号：ON786711)，BLAST比对分析发现，与桑树链霉菌Streptomycessamsunensis(登录号：MK530504)相似性达99%以上，在系统发育树中处于同一独立分支上(见图3)。结合以上研究，确定放线菌D2-3为链霉菌属的桑树链霉菌S.samsunensis。

图3 基于16S rDNA序列构建的放线菌D2-3系统发育树

3 结论与讨论

由奇异根串珠霉菌引起的椰子泻血病、茎干腐烂病是椰子的重要病害，目前主要以化学防治为主，以拮抗放线菌为代表的生物防治鲜有报道。以放线菌为代表的生防微生物及其代谢物种类丰富，是生物防治植物病害的重要来源，已广泛用于新药研发和生防微生物作用机制研究[25]。本研究从海南省文昌市、琼海市、万宁市、定安县及屯昌县共10个槟榔园土壤样品中分离纯化获得放线菌120株，初筛出22株对奇异根串珠霉菌有抑菌活性，占获得的放线菌总数的18.33 %；复筛后获得4株菌株抑菌效果达90 %以上，编号分别为D2-3、G1-12、D2-9和G9-4。经鉴定，菌株D2-3为桑树链霉菌Streptomycessamsunensis，属于紫黑链霉菌Streptomycesviolaceusniger16S rRNA 基因进化分支[26]。

紫黑链霉菌是新型抗生素开发与利用的重要菌源，许多重要的抗生素均由该菌产生，对植物病害具有良好的拮抗效果[27-29]。桑树链霉菌对植物病原菌的防控效果研究报道较少，刘一贤等[27-28]从云南省植胶区根际土壤中筛选到对橡胶树多种重要病害都具有较强抑制作用的桑树链霉菌17-7。本研究筛选到的桑树链霉菌菌株D2-3，对奇异根串珠霉菌菌丝生长抑制率达到99.76%，生防应用前景良好。下一步拟对该菌抑菌谱，发酵条件，以及在椰子植株体内和栽培基质中的定殖能力，定殖后的生防能力等方面进行深入研究，并分析其代谢产物中的抑菌活性物质，明确其抑菌机制，为该菌的利用奠定基础。