Nrf2-ARE 信号通路在帕金森病中的作用

刘继红 邵思迈 赵振荣 史 洺 郝 莉 张紫娟 张振强*

(1.河南中医药大学医学院,郑州 450046；2.河南中医药大学中医药科学院,郑州 450046)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是目前除阿尔茨海默病以外的第二大常见中枢神经系统退行性疾病,其主要以上肢静止性震颤伴有运动迟缓、僵硬和步态困难为主要临床症状。随着老龄化人口的增加,65 岁以上老年人的PD 发病率急剧上升,已成为全球增长最快的老年神经退行性疾病。预计到2040 年,PD 患者将超过1200 万[1]。PD 引起的高致残率给病人、家庭和社会带来了巨大的经济损失。

PD 的主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元的丢失及纹状体中多巴胺递质的丢失[2]。迄今为止,还没有可以阻止PD 进展的有效药物。虽然抗胆碱能药、多巴胺类药和多巴胺受体激动剂已用于治疗PD,但其疗效不好,副作用也较明显,因此对于PD 有效药物的探求迫在眉睫。

PD 的发病机制涉及多种学说,如神经炎症学说,线粒体功能障碍学说和氧化应激学说等,其中氧化应激学说得到广泛认可,抗氧化疗法逐渐成为近些年来攻克帕金森病的重要研究方向。在神经元对抗氧化应激的过程中,抗氧化信号通路发挥了重要作用。Nrf2-ARE(nuclear factor erythroid-2 related factor2,Nrf2/antioxidant response element,ARE)信号通路是一条重要的抗氧化通路,可通过调控下游抗氧化蛋白的表达进而逆转机体的氧化损伤,降低多巴胺能神经元的丢失,已成为研究帕金森病抗氧化疗法的重要靶点。本文从抗氧化应激的角度探讨了Nrf2-ARE通路在帕金森病治疗中的作用。

1 氧化应激与帕金森病

正常人体中脑黑质致密部的多巴胺能神经元通过分泌多巴胺(dopamine,DA)控制运动的灵活和平衡[3]。当黑质致密部的DA 水平降至70%～80%以下时,会出现包括运动迟缓、静止性震颤、僵硬和姿势不稳等帕金森病的症状[4]。黑质致密部的氧化应激是导致多巴胺能神经元丢失的重要机制[5-8]。

氧化应激是细胞内源性活性氧(rereactive oxygen species,ROS)的代谢失衡即ROS 产生过多而清除减少,它通过对不同的生物分子造成不可逆转的损伤和改变不同的信号通路而导致毒性[9]。Angelova 等[10]认为氧化应激使得脂质过氧化的产物代谢失衡,触发了神经元的坏死和凋亡。Musgrove 等[6]利用体内、外实验证实了ROS 的聚集会引起迷走神经背核的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)向中脑的转移并在中脑神经元中异常聚集,触发神经元的凋亡,因此ROS 的代谢失衡是PD 重要的致病机制。而神经元高氧量的需求和高能量的产生,使它成为了ROS 产生的重要场所,也使PD患者中脑黑质致密部成为氧化应激的主要场所[10-11]。因此抗氧化疗法成为研究治疗PD 的重要方向。

虽然抗氧化剂在PD 的体内外模型中显示出重要的保护作用,但在临床试验中几乎没有一种抗氧化剂被证明是有效的[10]。因此科学家们将研究的重点放在了抗氧化过程的重要信号通路上,如Nrf2-ARE信号通路,因此探究Nrf2-ARE信号通路在生命活动中的抗氧化作用对于阻断帕金森病的进行性脑损伤具有巨大的研究价值。

2 Nrf2-ARE 信号通路与氧化应激

2.1 Nrf2-ARE 信号通路的调节机制

核因子E2 相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是真核生物中一个重要的抗氧化转录因子,属于碱性亮氨酸拉链(cap‘n’collarbasic leucime zipper,CNC-bZip)转录因子家族[12]。Nrf2 由605 个氨基酸组成,可分为七个功能结构域(Neh1-7),其N 端的Neh2 结构域是抑制蛋白E3 泛素连接酶复合物底物(cullin 3/ring-box1)接头蛋白Kelch 样ECH 相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)的结合位点,通常情况下,同源二聚体Keap1 通过两个基序(低亲和力的DLG 基序和高亲和力的ETGE 基序)与一个Nrf2 分子的Neh2结构域结合,一旦结合,Nrf2 就被Cullin3 精确定位于两个基序之间的七个赖氨酸残基上进行泛素化降解,因此在细胞内的浓度较低[13-14]。Nrf2 的Neh1 结构域具有其基本的CnC-bZip 基序,在氧化和亲电应激条件下,由于Keap1 中的半胱氨酸残基的化学修饰(例如氧化和烷基化)改变了Keap1 的底物适配器功能,使其不能针对Nrf2 进行降解,但是Nrf2 仍然能够与Keap1 结合,使可用的Keap1 同源二聚体饱和,并允许新结合的Nrf2 移位到细胞核中,同小分子肌动蛋白(small Maf proteins,sMaf)进行二聚化,并与细胞核中的抗氧化反应元件ARE序列结合,促进了抗氧化物的转录和表达[15]。

抗氧化反应元件ARE是Nrf2 的结合靶点,存在于细胞保护基因的启动子调控区。在正常情况下,ARE被sMaf 蛋白阻断,sMaf 没有转录激活结构域,即使与ARE结合,其靶基因的表达仍不能被激活[16]。而在亲电体和活性氧的刺激下,Nrf2 入核与sMaf 形成异构二聚体,其形成的二聚体与ARE结合才能激活靶基因的转录[17]。因此在一般情况下,Nrf2 不能入核进行其下游靶蛋白的表达,但在氧化应激条件下Nrf2 可入核并激活下游靶基因的转录。

2.2 Nrf2-ARE 信号通路调控的下游靶蛋白

Nrf2-ARE通路激活后可调节一系列细胞保护蛋白基因的表达,这些蛋白参与了许多细胞过程,包括活性氧的清除、异物代谢、谷胱甘肽和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(又称还原性辅酶Ⅱ,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NAD(P)H)的稳态以及自噬等[18-19]。我们将这种保护途径称为解毒系统,其所包含的物质包括氧化还原因子(第一阶段),结合酶(第二阶段),药物外排转运体(第三阶段)。其中第一阶段包括500 多种产物,包括氧化还原平衡因子、应激反应蛋白、解毒酶和代谢酶的编码基因,如醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathionine S-transferase,GST)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GSR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)以及羰基还原酶等等。代谢物在此之后经历第二相代谢,在那里它们与大的极性基团(如葡萄糖醛酸、谷胱甘肽、硫酸盐或甘氨酸)结合,以增加它们的水溶性并促进它们的排泄[20]。

3 Nrf2-ARE 信号通路的激活与帕金森病

为探究PD 与Nrf2 之间的相关性,Petrillo 等[21]采集了45 名PD 患者的外周血并对其进行检测,发现Nrf2 及其下游靶基因NQO1、谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase,GCL)、GSR 在PD 患者外周血白细胞中表达上调,表明PD 患者Nrf2 通路被激活,并且对细胞的氧化应激产生了良性调节作用。Nakano-Kobayashi 等[22]在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的PD 小鼠模型中,检测到抗氧化药物可使PD 小鼠纹状体中Nrf2 及其下游转录蛋白NAD(P)H、NQO1 和HO-1 均高表达。MPTP 是一种神经毒性药物,对多巴胺能神经元具有定向破坏性,可造成实验小鼠的类PD 运动功能障碍,已被证实是一种重要的帕金森小鼠模型药物[23-24]。因此,Nrf2-ARE信号通路的激活对于PD中神经元的抗氧化具有重要意义。

3.1 Nrf2-ARE 信号通路促进PD 中抗氧化应激

氧化应激是导致PD 发病的重要机制,Nrf2-ARE作为一条重要的抗氧化调节通路,在PD 的抗氧化中发挥了重要作用,虽然其具体机制尚未完全阐明,但研究者们已通过建立多种PD 体内、外模型,来探究Nrf2-ARE信号通路在PD 中的抗氧化应激作用。

3.1.1 Nrf2 调控NQO1 的表达

越来越多的证据表明,在PD 患者中DA 的氧化及随之而来的醌修饰所产生的多巴胺琨(dopamine quinones,DAQ)具有高度的神经毒性,是造成多巴胺能神经元丢失及PD 运动障碍的重要机制[25]。NQO1 是Ⅱ相解毒酶家族的成员,它可防止环化醌类化合物在氧化还原循环过程中产生的破坏作用和氧化应激。Luo 等[26]证实了NQO1 在MPTP 诱导的PD 小鼠模型中通过抑制ROS 来降低黑质神经元的神经毒性。Kaji 等[27]用鱼藤酮诱导的PD 小鼠模型进行实验观察到Nrf2 的核转位与NQO1 的表达密切相关。此研究被Monir 等[28]证实,即在鱼藤酮诱导的PD 大鼠模型中,通过观察大鼠纹状体中Nrf2 与HO-1 和NQO1 表达上调的一致性,建立起三者之间的密切相关性。因此,多方面的研究表明了NQO1 为Nrf2 通路下游靶蛋白产物之一。

3.1.2 Nrf2 调控HO-1 的表达

HO-1 是血红素加氧酶家族的一员,在体内介导有毒的血红素分解代谢,使之分解为具有清除自由基能力的胆绿素和胆红素来为细胞提供保护作用[29]。除此之外,在氧化应激条件下,HO-1 还可通过保护氧化损伤,调节炎症来调节细胞凋亡以促进血管生成[30]。据报道,HO-1 对多巴胺能神经元的保护也可通过激活胶质细胞源性和脑源性神经营养因子的合成来实现。因此,HO-1 在PD 氧化损伤的修复发挥着重要作用。

多种证据已经表明HO-1 的表达受到Nrf2 的调控。Kim 等[31]在MPTP 诱导的PD 小鼠模型中,通过Nrf2 激活剂上调Nrf2 的表达,观察到HO-1 与之正相关性表达,这种高表达减轻了小鼠黑质中多巴胺能神经元的变性以及运动障碍。Kwon 等[32]用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的神经毒性和氧化应激在体外细胞模型中模拟PD 的神经病理症状,并用金丝桃苷作为治疗药物,观察到了依赖于Nrf2 的HO-1 的强表达,并且抑制了6-OHDA 诱导的氧化应激引起的神经元死亡。而柳雪蕾等[33]在通过艾灸治疗6-OHDA 诱导的PD 大鼠模型中观察到,在纹状体中检测到Nfr2 的激活及HO-1 表达的增加。这一点也在其它PD 的体内模型被证实,张辉等[34]在鱼藤酮塑造的PD 小鼠模型中,用银杏叶提取物有效地激活了其脑内Nrf2-ARE抗氧化通路,诱导HO-1 的高表达,改善其脑内的氧化应激,保护黑质中的多巴胺能神经元,进而改善其运动障碍。因此,多方面的证据表明了HO-1 即为Nrf2 通路下游靶蛋白,在PD 中发挥了积极作用。

3.2 Nrf2-ARE 促进了PD 中线粒体功能的正常运行

线粒体通常被称作“能量工厂”,这归结于它们在OXPHOS 过程中合成的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)为细胞的生命环节提供能量[35]。氧化磷酸化的过程对于神经细胞来说至关重要,因神经元中的神经代谢较为旺盛,需要高水平的ATP来进行神经传递和维持跨膜细胞的离子梯度[36]。但同时,线粒体也是细胞内源性ROS 的主要来源[37]。线粒体中电子传递链(electron transport chain,ETC)复合物I 和II 处的电子泄露、复合物I的损伤及线粒体的分裂都会导致氧的不完全还原,从而形成超氧化物,对神经元造成不可逆的损伤[38]。Petrillo 等[21]的临床研究证实了Nrf2 在PD患者外周血白细胞中高表达,且参与细胞线粒体中氧化应激的防御。

Nrf2 不仅可以通过其下游抗氧化蛋白的表达来抑制线粒体内膜上所发生的氧化损伤,还可通过影响线粒体动力相关蛋白来影响线粒体的发生,这主要是通过抑制线粒体的异常分裂来完成的[39]。Zhang 等[40]在鱼藤酮诱导的PD 大鼠模型中,使用岩藻糖胶激活Nrf2 通路,改善线粒体形态和呼吸能力,提高线粒体复合体I 的活性,降低了PD 模型鼠纹状体中神经元的死亡。

Martinez 等[41]利用鱼藤酮和MPTP 诱导了PD小鼠模型,并通过抑制ETC 而诱发了PD 的相关运动障碍。Holmström 等[42]利用Nrf2-KO(Nrf2 基因敲除)小鼠胚胎成纤维细胞与野生型小鼠的成纤维细胞对比发现,Nrf2-KO 细胞中的线粒体膜电位显著降低并观察到线粒体去极化,ATP 水平降低及呼吸功能受损,而Nrf2 基因激活增加了线粒体膜电位和ATP 水平,提高了线粒体的呼吸速率和氧化磷酸化的效率。

因此,Nrf2 除了通过上调其下游抗氧化蛋白的表达进行抗氧化应激之外,还可提高线粒体膜电位,上调线粒体呼吸作用,氧化磷酸化和ATP 的合成,并且在维持线粒体动态平衡等方面都发挥了重要作用。

3.3 Nrf2-ARE 信号通路抑制了PD 中的铁死亡

铁死亡是一种铁依赖性的、与氧化密切相关的、非凋亡形式的细胞死亡。铁是一种在生物圈中普遍存在的过渡金属,由于其参与电子转移反应的作用,对于正常的细胞功能必不可少。但过量的铁可以产生有毒的ROS,对细胞造成不可逆的损伤[43]。Zucca 等[44]对这一现象做出了更加详细的解释,即当含有神经黑色素的细胞器在衰老过程中积累了大量毒素和铁时,神经退化过程就会被触发。这个过程具体来说主要包括:多巴胺可以被铁氧化形成多巴胺醌,此过程跟与铁依赖发生的芬顿反应(H2O2被亚铁还原生成羟自由基-OH,导致的强氧化应激反应)密切相关,多巴胺醌可以进入细胞的毒性途径,与不同蛋白质的氨基酸残基(主要是半胱氨酸残基)形成加合物,对蛋白质造成损伤。

Nrf2 途径可通过挽救细胞氧化损伤进而抑制PD 中多巴胺能神经元的铁死亡。Han 等[45]通过对比发现,老龄鼠中脑黑质和纹状体中铁含量明显高于青年小鼠,而在过表达Nrf2 的PD 模型鼠中,铁沉积显著减少,同时该过表达组的ROS 的生成和氧化应激水平被显著减少。这项研究直接证明了Nrf2通过减少氧化应激来降低PD 中脑神经元的铁死亡。而Sun 等[46]做了更加细致的研究,他们在体内斑马鱼和体外人多巴胺能细胞系(SH-SY5Y 细胞)模型中通过上调Nrf2-ARE信号通路,观察到促进Nrf2 核移位和上调抗氧化蛋白血红素加氧酶-1(HO-1) 的表达对 6-羟基多巴胺 (6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的多巴胺能细胞铁死亡具有保护作用。

因此,在PD 中,神经黑色素的积累导致了细胞内铁的沉积,进而促进了细胞过量的活性氧的生成,触发了细胞死亡,但是Nrf2-ARE信号通路可通过促进下游抗氧化蛋白的表达来抑制细胞的这种铁依赖性死亡。

3.4 Nrf2 其它途径的神经保护作用

值得注意的是,虽然广泛的研究集中于Nrf2-ARE通路的抗氧化作用,但其抗炎和抗凋亡作用也值得深入研究。

核转录调节因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是细胞中重要的炎症反应调节因子,对具有神经毒性的炎症介质的产生发挥了关键作用[47-48]。Wardyn 等[49]认为Nrf2 的缺失会提高NF-κB 的活性,导致细胞炎症因子产生增加,而NF-κB 通路又可反向调节Nrf2 的转录和活性,对其靶基因表达有双重影响,但其相互作用机制尚待进一步研究。

此外,Lim 等[50]通过使用Nrf2 激动剂观察到MPTP 诱导的PD 小鼠模型中线粒体凋亡蛋白的表达下调从而逆转了线粒体凋亡。推测,Nrf2-ARE通路的激活可通过调节凋亡蛋白进而减轻多巴胺能神经元的死亡。因此Nrf2-ARE通路不仅在PD 中发挥了重要的抗氧化作用,而且在抗炎和抗凋亡途径中也发挥了不可忽视的作用,但其具体作用机制尚不清楚。

4 结语

帕金森病的发病机制至今尚未完全探明,但氧化损伤已被认为是重要的发病机制,抗氧化疗法已成为治疗帕金森病的重要研究方向。本文从分子角度结合近几年的实验研究探究了Nrf2-ARE通路在PD 中的抗氧化作用:从Nrf2-ARE通路的结构,分析其通过促进下游抗氧化酶的生成,进而逆转了线粒体功能,降低了细胞的铁死亡途径。除了抗氧化作用的调节之外,Nrf2 还可通过抗炎和抗凋亡途径,实现对PD 的正向保护调节。Nrf2-ARE通路在PD 中的抗氧化作用提示我们在日后对PD 的研究中,可通过探究此通路中相关蛋白的表达来研究药物对于PD 的神经保护作用,同时,Nrf2-ARE通路在抗炎与抗凋亡途径的作用机制尚未完全清楚,具有较大的研究潜力,相信通过日后对调节此通路的药物的相关研究将会为帕金森病患者带来希望。