龙胆苦苷用于治疗肝脏疾病的研究进展

孟杨 刘东璞 苗长喻 张辉 邱艳杰

(1佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2黑龙江省微生物-免疫调解网络与相关疾病重点实验室；3佳木斯市妇幼保健院)

肝脏疾病主要包括病毒性肝炎、肝脓肿、肝结核、脂肪肝、肝血吸虫病、肝内胆管结石、肝硬化、肝衰竭和肝癌等。随着生活水平的提高，我国肝病患者越来越多，特别是肝硬化和肝癌发病率急剧增高〔1〕。虽然在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性脂肪性肝病(AFLD)、肝纤维(HF)、肝癌等肝脏疾病领域实验性研究颇多，但其发病机制仍不明确。由于传统中草药提取物具有价格低廉、副作用小、作用广泛等特点，人们开始尝试采用中草药单体治疗肝脏疾病。龙胆苦苷(GPS)为一种裂环烯醚萜苷类物质〔2〕，是从龙胆草中提取的天然产物单体，而龙胆草是广泛用于治疗肝脏疾病的代表龙胆泻肝丸的主要中药组成之一，其主清热除燥、入肝胆经，对肝脏有很好的保护作用〔3〕。研究表明GPS能减缓或逆转肝损伤、NAFLD、酒精性肝炎及肝内胆汁淤积等疾病，其机制主要与降低炎症反应、抑制氧化应激、调节血脂和增强机体免疫力有关〔4,5〕。本综述将对GPS在NAFLD、AFLD、HF、肝癌发生、发展中的作用途径进行总结，旨在为NAFLD、AFLD、HF、肝癌的治疗提供新的思路，也为可能开发GPS为保肝药物奠定基础。

1 GPS和NAFLD

NAFLD是指无过量饮酒史，而由糖脂等代谢异常引起的脂肪颗粒在肝脏中聚集，最终引起肝细胞脂肪变性的一种临床病理综合征〔6〕。伴随着物质生活的提高和人们饮食布局的调整，NAFLD患者在我国越来越呈现低龄化趋势，不合理的饮食习惯、熬夜、缺乏运动、患有基础性疾病等内外因素都能诱发NAFLD〔7〕。NAFLD主要是以糖脂代谢异常为发病核心，整个糖脂代谢的进程中，有主要作用的是在脂肪酸代谢中过氧化酶体的β氧化〔8〕。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)ɑ属于PPAR家族蛋白的一员，其对NAFLD发生及发展都有一定调控作用，其主要是介导转录水平调控脂肪酸氧化体系各种酶。研究表明，NAFLD模型大鼠的酰基辅酶A氧化酶(ACOX)1和PPARɑ表达较低，而采用GPS进行治疗后可以明显提高ACOX1和PPAR表达〔9〕。武俊紫等〔10〕用高营养饲料建立大鼠模型，通过使用的不同浓度GPS干预NAFLD进程，发现高剂量组治疗NAFLD效果最显著，同时发现经过GPS治疗后， 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平都有一定降低。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)信号通路与糖尿病的关系密切，但是近些年来大家广泛关注AMPK与NAFLD的相关性。研究表明测定AMPKα和p-AMPKα蛋白表达水平发现，p-AMPKα的蛋白水平经过GPS治疗具有显著性差异，然而AMPKα的蛋白表达在各实验组并没有明显差异〔10〕，推测AMPK并不是直接发挥作用，而是通过磷酸化转化为p-AMPKα促进能量代谢。证实GPS是通过升高p-AMPKα水平，提高能量代谢，减轻炎症反应来改善NAFLD。AMPK的激活同时可促进下游分子核转录因子E2相关因子(Nrf)2的细胞核转位，上调Nrf2表达〔11〕。Nrf2是通过调节因子抗氧化、抗炎、减轻炎症反应，进而介导下游血红素加氧酶(HO)-1减轻肝脏氧化应激〔12〕。与NAFLD大鼠模型组比较，GPS各剂量组可显著增强 p-AMPK、Nrf2蛋白表达水平，表明GPS是由于激活AMPK/Nrf2信号途径，进而缓解氧化应激之后达到保护肝脏的作用〔13〕。NAFLD也是一类和胰岛素抵抗紧密有关的代谢应激性疾病，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)是和胰岛素作用关系紧密的通路之一。实验发现，Nrf2/HO-1通路是保护肝脏抑制氧化应激损伤的主要传导通路之一〔14〕。研究报道采用GPS治疗可有效缓解泰洛沙泊引起的大鼠NAFLD，表明GPS通过激活Nrf2/HO-1、PI3K/Akt信号通路，进而发挥抗炎、抗氧化、减缓胰岛素抵抗作用，并提高p-AMPK的水平，导致脂质累积减少〔15〕。Jin等〔16〕研究发现GPS可以通过提高细胞活力、减少脂肪沉积、下调三酰甘油(TG)和激活游离脂肪酸(FFA)诱导的HepG2细胞核Nrf2来有效缓解NAFLD。

2 GPS和AFLD

AFLD是指由于酒精摄入不合理(指每日喝酒量折合酒精40 g以上或每周140 g以上者) 而致使的一系列肝脏损害病变，从而进展为肝炎、HF，最终会导致肝硬化及一系列特重并发症〔17〕。AFLD患者首先应该进行戒酒，但戒酒对于晚期AFLD已无法逆转，对于末期AFLD患者只能进行肝移植进行治疗。近些年来，在医学方面并没有成熟的治疗AFLD方法，也没有好的方法能够显著提高AFLD患者生存率。 所以，成熟的AFLD的治疗药物应该是可筛选的、有效果的、无副作用的。在整个AFLD的病理过程中，PPARɑ和胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1发挥着重要作用，它们通过调节脂质的累积和脂肪酸的氧化影响AFLD发生、发展。酒精的摄取会直接或间接影响和脂质代谢有关的转录因子，然后抑制脂肪酸氧化和促进脂肪酸合成〔18〕。Li等〔19〕研究发现用酒精诱导的小鼠慢性和急性AFLD损伤模型中，GPS可减少丙氨酪氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和积累的TG含量。也发现GPS可提高肝激酶(LKB)1和AMPK表达水平，进而来调节SREBP1表达水平。另外，研究证实GPS可调节PPARɑ和磷酸化的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)表达水平。GPS可使P2X嘌呤受体7(P2X7受体)-NOD样受体蛋白(NLRP)3炎性小体的活化受到阻碍并抑制了白细胞介素(IL)-1β的产生。张玉〔20〕研究发现，在乙醇暴露的HepG2细胞中，GPS通过激活 P2X7受体-NLRP3炎性体减少脂肪生成并促进脂质氧化。P2X7受体的遗传或药理学阻断增强了AMPK活性并降低了乙醇处理的HepG2细胞中SREBP1表达。GPS可下调由于脂多糖/三磷酸腺苷刺激的RAW264.7巨噬细胞和骨髓衍生巨噬细胞中P2X7受体介导的炎症反应。来自巨噬细胞的IL-1β加速了肝细胞脂质积累。氯膦酸盐脂质体消耗巨噬细胞改善了酒精性肝脂肪变性，GPS进一步缓解了这种情况。Zhang等〔21〕研究发现，GPS通过调节血脂水平，增加抗氧化能力，对AFLD大鼠表现出良好的保肝活性。其潜在机制与通过恢复线粒体膜电位水平、ATP浓度、三羧酸循环关键酶活性和复合物Ⅳ活性、调节小分子代谢和抗细胞凋亡来调节线粒体功能障碍有关。Yang等〔22〕研究发现，GPS预处理改善了慢性乙醇喂养C57BL/6小鼠引起的脂质代谢失衡，以调节脂质积累为特征。在乙醇处理的AML12细胞中也证实了GPS抑制脂质合成和促进氧化。GPS可以防止肝脏脂肪变性发展为慢性酒精暴露引起的轻度纤维化，这表明GPS可能是一种有前途的治疗AFLD早期的疗法。

3 GPS和HF

HF是肝脏受到体内外各种致病因子侵袭后，过度修复进而引起肝脏各种细胞发生病理性改变，最终致使纤维化形成〔23,24〕。HF是可逆的，如果及时进行治疗，就可以逆转病情。近些年来使用中药治疗HF引起广泛重视。音猬因子(Shh)信号途径是作用于HF过程中的主要通路之一，阻止Shh信号途径可能是医治HF的有效靶点〔25〕。李梓萌等〔26〕研究结果表明，采用GPS给药后，大鼠肝组织Shh、Gli家族锌指蛋白(Gli)1、转化生长因子(TGF)-β1和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的蛋白表达水平显著降低，表明采用GPS治疗有抗HF的作用，可能是抑制Shh信号通路发挥作用。细胞外基质(ECM)的主要成分包括透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)等，HF发展过程中的时候，ECM异常沉积导致HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C升高〔27〕。研究证实使用GPS后大鼠血清中HA、LN、PC Ⅲ及Ⅳ-C含量显著降低〔26〕，可推测GPS对大鼠HF具有保护作用。HF的发展阶段大致可分为肝损伤、肝星状细胞(HSCs)的活化同时分泌细胞因子和胶原，ECM代谢异常三个阶段〔28〕。CCl4是建立HF小鼠模型的经典诱导剂，CCl4致HF大鼠模型的病理学变化与人类HF的病理学改变较接近〔29〕。研究证实GPS干预能有效缓解CCl4导致的血清ALT、AST活性升高〔30〕。萨可佳〔31〕研究发现GPS给药组肝脏结构清晰完整，未发现明显的损伤，尤其GPS高浓度组改善尤为显著，表明使用GPS对由于CCl4导致的肝脏受损有干预作用。也有实验证实GPS可使Toll样受体(TLR)4/MyD88/核因子(NF)-κB信号通路受到抑制，从而导致下游炎症效应因子的降低，因而起到保肝作用〔32〕。还有研究发现GPS可抑制由氨基半乳糖(d-GalN)/脂多糖(LPS)引起的肝损伤，其机制主要由于其抗凋亡活性〔33〕。HF的过程中会伴随着不同程度的氧化应激，有效抑制氧化应激是抗HF的重要手段。大鼠肝脏受到CCl4的刺激时，在健康情况下，机体存在的抗氧化防御机制可以维持机体内自由基的生成与降解处在动态平衡，并产生总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)来保护机体免受自由基和活性氧氧化应激刺激，T-SOD和GSH-Px可通过加强机体抗氧化功能维持机体平衡。研究发现GPS给药后能显著降低大鼠丙二醛(MDA)含量，升高T-SOD和GSH-Px活性，推测GPS可以有效降低CCl4致小鼠的氧化应激水平〔34〕。

4 GPS和肝癌

肝癌是全世界难治愈的恶性肿瘤之一，连续多年来，我国肝癌病人的负担持续加重，患病率、发病率和死亡率均呈上升趋势。肝癌前期不容易觉察，大多数病人被诊断时已处于肝癌末期，错过了最好的治疗时间。由于从传统中药中提取的天然产物具有副作用低、疗效确切、多靶点、多途径等优势，在肝癌治疗领域逐渐引起了人们的关注。黄馨慧等〔35〕的实验证实SMMC-7721肝癌细胞经104nmol/L和102nmol/L的GPS作用48 h后，细胞活力降低，其细胞活力值与对照相比差异显著(P<0.01)。赵忠伟等〔36〕研究发现人肝癌细胞HepG2经GPS作用后，增殖明显减慢，且与GPS的剂量呈依赖性;也发现GPS对人肝癌细胞HepG2周期有明显影响，无论是DNA合成期还是G2/M期细胞都有不同程度减少，同时也使细胞停滞在G0/G1期。张志恒等〔37〕给小鼠皮下注射H22细胞悬液建立小鼠肝癌模型，研究发现使用GPS治疗后，小鼠体重无明显变化，而瘤重变化有显著差异，胸腺指数和脾指数也有不同程度的升高，而瘤组织碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、TGF-β、血管内皮生长因子(VEGF)、p-PI3K及p-Akt表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。说明GPS对H22肝癌小鼠肿瘤生长有抑制作用，该作用与提高免疫力，增加血清干扰素(IFN)-γ、IL-2含量及抑制PI3K/Akt信号通路的活化有关。Huang等〔38〕研究结果显示GPS可诱导HL1C肝癌细胞Akt磷酸化并抑制HL1C肝癌细胞胞质形式的磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PCK)1 mRNA表达，还可诱导细胞外信号调节酶(ERK)1/2磷酸化。综上，GPS可通过升高p-AMPKα蛋白、激活AMPK/Nrf2、Nrf2/HO-1、PI3K/Akt信号通路调控NAFLD；通过升高LKB1、AMPK蛋白水平，调节SREBP1、AMPK、PPARɑ、ACC表达水平等作用延缓AFLD病程；通过降低HA、LN、PC Ⅲ及Ⅳ-C的含量等作用减轻HF程度；GPS可使SMMC-7721肝癌细胞活力降低，可抑制H22肝癌小鼠肿瘤生长。由于肝脏疾病的复杂，在临床上并没有特别有效的治疗方法，本文阐述了GPS在NAFLD、AFLD、HF、肝癌的药理作用，但对于GPS在肝脏生理及病理中的作用还没有完全阐明，需进一步研究。