卡介苗与儿童原发性免疫缺陷病

贺建新

（首都医科大学附属北京儿童医院呼吸一科，北京 100045）

卡介苗（Bacille Calmette-Guérin, BCG）是来源于牛结核分枝杆菌的经多次传代培养的毒力减弱的活疫苗，可预防粟粒性肺结核和结核性脑膜炎。几种儿童原发性免疫缺陷病（primary immunodeficiency disease, PID）对BCG 疫苗株敏感。本文介绍重症联合免疫缺陷病（severe combined immunodeficiency, SCID）、慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease, CGD）、呈孟德尔遗传的分枝杆菌病（Mendelian susceptibility to mycobacterial disease,MSMD）的发病率、发病机制、临床表现，尤其重点介绍与BCG 相关的疾病特点、治疗原则及预后。探讨该类脆弱儿童避免接种BCG 的可能策略。

1 BCG及BCG病

1.1 BCG

分枝杆菌、棒状杆菌及诺卡菌共同组成放线菌家族中的单系分类单元。这些革兰阳性菌的分枝菌酸组成蜡样细胞壁，具有抗酸及抗乙醇特性，使之与其他细菌区别。棒状杆菌大多寄生于人或动物鼻腔、咽喉、外耳道、外阴、泌尿道和皮肤等处，大多为条件致病菌。诺卡菌为需氧菌，存在于土壤，接触后感染局部皮肤，吸入后感染肺部，若存在免疫缺陷则发生播散感染。分枝杆菌具有独一无二的生化途径，使之与棒状杆菌及诺卡菌区别。分枝杆菌多样化明显，具有85 个不同的属。基于16s RNA，RNA 聚合酶（RpoB），hsp65基因测序，可迅速鉴定属并建立系统进化树。根据体外培养表型可分为强毒力和弱毒力、慢生长和快生长分枝杆菌。结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）属于强毒力慢生长分枝杆菌。也有几种BCG疫苗株，BCG 属于弱毒力慢生长分枝杆菌。环境分枝杆菌（environmental mycobacteria, EM）中 EM.ulcerans 毒力稍强，其他属于弱毒力分枝杆菌，其中慢生长EM 包括M.avium、M.kansasii、M.szulgai 等，快生长EM 包括M. chelonae、M.abscessus、M.peregrinum、M.smegmatis、M.fortuitum 等。大部分分枝杆菌是环境中自由生长的腐生菌。在饮用水供应系统的标本中倾向于检测到鸟分枝杆菌，生物膜上可检测到胞内分枝杆菌。分枝杆菌从未在健康人的皮肤或黏膜获得培养，MTB 和BCG 从未在环境中获得鉴定[1-3]。

BCG 疫苗株源于1921年获得的牛结核分枝杆菌，经多次传代培养后毒力减弱，国内常用的为丹麦菌株。需要特殊的培养基和延长的培养时间来最大化BCG 的产量。BCG 缺乏差异1 区（region of difference 1, RD1），该域区编码早期分泌抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10），BCG 感染不会刺激效应T 细胞分泌γ 干扰素（IFN-γ）[4]。

1.2 BCG病

BCG 被认为是最安全的疫苗之一，但仍有少部分儿童接种后出现BCG 感染，即BCG 病。BCG 皮内接种的最初皮肤损伤为注射部位5～15 mm 的红色浸润，2～3 周后变为蓝红色的脓疱，4～6 周后出现溃疡、引流和渗出性结痂形成，最后中心结痂遗留小的残留疤痕。BCG 接种经常引起局部反应，严重或长期并发症少见。局部反应包括中度同侧腋下或颈部淋巴结肿大（BCGitis）、接种部位浸润及随后脓疱形成，这些反应可持续至接种后3 个月。略严重局部反应包括接种部位溃疡、局部化脓性淋巴结炎伴引流窦道形成及在接种部位干酪损伤或脓汁引流，这些特征可在接种后5 个月出现，持续数周。最严重的并发症是播散性BCG 感染（BCGosis），最常见播散性感染是BCG 骨髓炎，通常出现于接种后4 个月～2年[5]。

BCG 不良事件被定义为：接种处愈合时间长，不愈合或病损广泛；愈合后瘢痕≥10 mm；注射部位化脓≥10 mm；腋下淋巴结肿大≥15 mm；化脓性腋下淋巴结炎；BCG 骨髓炎或BCGosis。根据感染距离将BCG 病分类：①局部：接种部位局部病损，接种部位脓肿直径≥10 mm 或严重疤痕溃疡。②区域：接种部位之外的任何区域淋巴结受累，同侧腋下、锁骨上、颈部和上臂，≥15 mm，包括肿大、化脓和窦道形成（小于1 岁同侧腋下淋巴结受累不太可能与其他因素相关，锁骨上和颈部淋巴结受累需除外其他因素）。③远距离：局部或区域之外的部位受累，至少1 个远隔部位受累如肺分泌物、脑脊液、尿、骨髓和远距离的皮肤。④播散：大于1 个远隔部位受累，和/或至少1 次血或骨髓培养阳性（远距离和BCGosis 在HIV 或免疫受损儿童症状可不典型，需保持高度警惕）[6-7]。远距离BCG 不良事件和BCGosis 被认为是潜在免疫缺陷的指征。

2 BCG病与儿童PID

2.1 PID的定义及分类

PID 是指原发的免疫系统的免疫器官、免疫活性细胞（如淋巴细胞、吞噬细胞）及免疫活性分子（如免疫球蛋白、淋巴因子、补体和细胞膜表面分子）发生缺陷引起的某种免疫反应缺失或降低，导致机体防御能力普遍或部分下降的一组临床综合征。最新的PID 分为10 类：①联合免疫缺陷：T 细胞缺陷、 B 细胞正常重症联合免疫缺陷病（T-B+severe combined immunodeficiency, T-B+SCID），T 细胞和B 细胞均缺如SCID（T-B-SCID），病情相对较轻的联合免疫缺陷病（combined immunodeficiency disease, CID）；②具有综合征特点的联合免疫缺陷；③以抗体为主的免疫缺陷；④免疫失调性疾病；⑤先天性吞噬细胞数量和/或功能缺陷；⑥固有免疫缺陷；⑦自身炎症性疾病；⑧补体缺陷；⑨骨髓衰竭；⑩PID 拟表型[8]。

2.2 BCG病的危险因素

皮肤损伤和医院接种容易发生BCG/EM 感染，其他容易感染的各种获得性免疫缺陷包括艾滋病、毛细胞白血病、骨髓和器官移植。人类遗传异常容易导致BCG/EM 疾病发生，如囊性纤维化患者经常受累慢性呼吸道EM 感染。播散性BCG/EM 病几乎无一例外提示潜在的孟德尔遗传异常，该类疾病分为两组：经典的PID 和MSMD[9]。

3 与BCG相关的儿童PID

3.1 SCID

SCID 包括一组遗传决定的T 淋巴细胞（以下简称T 细胞）分化障碍性疾病。不同分子缺陷导致T 细胞发生内在损伤，同时伴有其他造血细胞系分化异常。根据SCID 发病机制分为：抗原受体基因重组（RAG、Artemis、Lig4、PRKDC）；T 细胞受体信号（CD3、CD45、ZAP70、ORAI1、STIM1）；T 细胞分化（IL-2RG、IL-7RA、JAK3、ADA、PNP、AK2）；胸腺发育和胸腺T 细胞输出（CATCH22、FOXN1、CORONIN-1A）。根据SCID 免疫表型分为：T-B-（RAG、ADA）；T-B+（IL-2RG、JAK3）；T-B+NK+（IL-7RA、CD3D、IL-2RA、PNP）；T+B+NK+（ZAP70）[10]。

美国的新生儿筛查发现，SCID发病率为1/5.8万，远高于既往回顾性诊断的1/10 万[11]。由于SCID 患儿缺乏成熟的T 细胞，不出现获得性免疫功能，机体对多种病原广泛敏感，其中机会性病原微生物占主导地位。经典SCID 患儿通常1 岁内起病，若不经过造血干细胞移植、基因治疗（IL-2RG、ADA）或酶替代（ADA）治疗，通常于2 岁内夭折。实验室检查血常规显示淋巴细胞明显降低，CD3、CD4、CD8的比例极度降低，CD3 绝对计数<100 μL（也有用300 μL 或500 μL）。经典SCID 通常无需其他实验室检查即可获得临床诊断。有2 种特殊类型SCID 需要特别关注。一种为减效SCID 基因突变导致的Omenn 综合征，表现为自体T 细胞在外周的克隆性扩张，此类细胞表现为活化伴记忆表型，分泌Th2型细胞因子。患儿严重感染同时具有红皮病、肝脾淋巴结肿大、嗜酸性粒细胞升高和IgE 升高[12]。另一种为母体T 细胞经胎盘输注导致的移植物抗宿主病（graft versus host disease, GVHD），临床与Omenn综合征难以区别，免疫表型也近似。SCID 患儿由于T 细胞缺陷，不能及时剔除母体T 细胞，其中一半导致轻的GVHD 表现，主要累及皮肤和肝脏[13]。上述两类患儿不具有经典SCID 的免疫表型，容易导致漏诊，需要结合原始CD4、淋巴增殖功能、γδT 细胞、T 细胞受体β 链可变区（TCRVB）等协助诊断。除上述2 种特殊情况外，有时减效SCID 基因突变可导致非经典SCID，患儿1 岁后起病，容易合并自身免疫表现，虽然存活时间延长，但最终结局不乐观[14]。此类患儿不具有经典的免疫表型，亦需要详尽的实验室检查来明确诊断。还有一类患儿，不符合经典和非经典SCID，被定义为CID，对此类患儿的治疗是巨大挑战，在脏器功能损害前给予造血干细胞移植，可明显改善预后[15]。

BCG 是细胞内病原菌，主要寄居于吞噬细胞内。天然免疫，尤其吞噬细胞的呼吸爆发、IL-12/IFN-γ 轴和T 细胞免疫在针对分枝杆菌的保护性免疫反应中至关重要。51%的SCID 患者出现BCG 感染，其中2/3 为BCGosis，1/3 为BCGitis。SCID 患儿≤1 个月龄接种BCG 则BCG 并发症出现率高及具有高的BCG 并发症相关的死亡率[16]。SCID 患儿BCG 病的危险因素是否受高死亡率影响，结论不一。有研究[16]发现CD3+T 细胞≤250 μL 的SCID 患儿患BCG病概率升高2.1 倍。在母胎植入或Omenn 综合征，T 细胞的存在不排除BCG 感染。NK 细胞计数降低和NK-SCID 是造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）前BCGosis 和HSCT 后持续BCGosis 的危险因素，提示NK 细胞对BCGosis 具有保护作用。78 例接种BCG 的SCID 患儿无BCG 病症状，接受抗BCG 治疗后2 例出现BCG 相关并发症，无死亡；160 例有BCG 病症状并行抗BCG 治疗的SCID 患儿46 例出现BCG 相关死亡[16-18]。

3.2 CGD

CGD 最初被定义为儿童致死性肉芽肿性疾病。后来发现患儿中性粒细胞体外可吞噬但不能杀灭金黄色葡萄球菌，吞噬乳胶颗粒后不能消耗氧和产生过氧化氢，故发现CGD 的发病机制为呼吸爆发反应缺陷。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶是呼吸爆发反应的关键酶，其膜亚单位（CYBB、CYBA）及胞浆亚单位（NCF1、NCF2）通过定位克隆逐步获得鉴定。吞噬细胞活化后，胞浆亚单位与膜亚单位结合，将电子从胞浆侧的NADPH 传递给空泡或细胞外间隙的氧，产生过氧阴离子。CGD 的国外发病率为1/20 万～25 万，患儿表现为早发、多发、严重、反复的细菌和真菌感染，在炎症部位形成肉芽肿[19-20]。

74% 的CGD 患儿患有BCG 疾病，CGD 患儿BCG 疾病平均确诊年龄为9.22 个月（0～84 个月），80%患儿在12月龄前获得确诊[21]。BCG 病的一个常见特征是早发年龄，接种后很快观察到接种部位局部脓肿或严重溃疡或局部同侧淋巴结化脓和/或窦道形成。55%患儿首发表现是BCG 病，但仅25%患儿启动了即刻免疫评估，提示初级保健医生认识的不足；CGD 患儿的BCG 病中约2/3 为BCGitis，1/3 为BCGosis，24%患儿只表现BCGitis；CGD 患儿局部BCG 感染更常见，具有BCGosis 的CGD 患儿，95%具有局部或非局部淋巴结炎；大部分仅有一个BCG 病；12%有一次复发[21]。BCG病晚期加重在成人CGD 患者中少见。日本推荐BCG 接种年龄为1 岁，80%的X-CGD 患儿在BCG 病前出现其他严重感染[22]。BCG 感染不依赖于CGD 基因型和突变类型。BCGosis 经常见于肺、肝和系统淋巴结，偶见腹膜和肠系膜淋巴结受累。不到10%的CGD 患儿的病理标本中可见细菌加真菌共感染，18%患儿具有MTB 和BCG 共同感染，44%患儿具有MTB 感染，24%患儿仅具有分枝杆菌感染[21]。CGD 患儿中MTB的高出现率大大超过局部儿童发生率，严重度和并发症也超过常见儿童结核病[21，23-25]。

动物模型显示，氧化呼吸是人类针对分枝杆菌免疫的重要组成部分[26]。CGD 患者的吞噬细胞体外不能破坏细胞内的BCG，提示氧呼吸爆发可限制BCG 复制[27]。X 连锁隐性2 型MSMD 患者CYBB 突变特异破坏单核细胞来源的吞噬细胞呼吸爆发可解释CGD 患者分枝杆菌敏感的细胞水平[28]。

3.3 MSMD

在没有经典PID 的相对健康人中，BCG 和EM可引起播散性疾病，这个综合征被命名为MSMD。至目前已鉴定出IFNGR1、IFNGR2、STAT1、IL-12B、IL-12RB1、IRF8、ISG15、CYBB、NEMO 等与此相关的IL-12/IFN-γ 通路基因，表现为21 种遗传异常[29]。

IFN-γ 信号在针对分枝杆菌的天然免疫中起重要作用。分枝杆菌感染后，抗原呈递细胞上的模式识别受体识别分枝杆菌的不同分子，产生IL-23（IL-12p40 和IL-23p19）和IL-18。IL-23 和IL-18 与自然杀伤细胞上的受体结合，活化IFN-γ 的产生。IFN-γ 与巨噬细胞和树突状细胞上的受体结合，导致细胞因子IL-12p70 和抗微生物机制中的各种分子的转录。IL-12p70 是异源二聚体，由IL-12A 基因编码的轻链IL-12p35 和IL-12B 基因编码的重链IL-12p40 组成。IL-12p40 对IL-12p70 是非特异的，与IL-23p19 相关形成IL-23。IL-12 通过IL-12 受体（由IL-12Rβ1 和IL-12Rβ2 组成的异源二聚体），刺激T 细胞和NK 细胞产生IFN-γ。IL-12Rβ1 与TYK2结合，IL-12Rβ2 与JAK2 结合。复合物的活化促进信号转导和STAT4 磷酸化，同源二聚体化，移入细胞核诱导IFN-γ 产生。IFN-γ 受体由2 个IFN-γR1和2 个IFN-γR2 组成，前者是配体结合链，后者是信号转导链。IFN-γR1 和IFN-γR2 一直与JAK1 和JAK2 有关。JAKs 相互磷酸化导致IFN-γR1 胞内区酪氨酸440 磷酸化。酪氨酸440 是STAT1 锚位。JAKs 介导STAT1 酪氨酸702 和酪氨酸727 磷酸化，导致磷酸化的STAT1 分子同源二聚体化。这些磷酸化STAT1 分子形成复合物，被称为γ-活化因子（GAF），移入细胞核，与各种基因的启动子结合活化转录。GAF 结合的启动子区被称为IFN-γ 活化位点（GAS），包括回文一致序列TTTCCNGG，活化的基因包括TNF、CXCL11、FCGR1A、各种IRFs 等[1-3]。

常染色体隐性（AR）完全性IFNGR1 缺陷的所有接种BCG 患儿均有BCG 病，77%有EM 感染，平均年龄3.1 岁[30]。分枝杆菌感染易反复，病情严重，无病间隔期短，存活率低，大部分患儿于儿童期死亡，不到20% 的患儿可存活到12 岁[30]。AR 部分性IFNGR1 缺陷和常染色体显性（AD）部分性IFNGR1缺陷患儿病情较AR 完全性IFNGR1 缺陷轻，前者大部分出现骨髓炎，后者鸟分枝杆菌骨髓炎更常见。AR 完全性IL-12RB1 缺陷最常见，表现为儿童早发的分枝杆菌病和沙门菌病，分枝杆菌病少复发，沙门菌病易复发，临床传递率高，感染谱广，预后不乐观。AR 完全性IL-12p40 缺陷临床表型与IL-12Rβ1 缺陷高度近似，特征为儿童早发的BCG病和沙门菌感染，临床传递率高但不完全，预后不良。IL-12p40 缺陷较以前认为的更常见，具有建立者效应。AD STAT1 功能丧失性缺陷患儿骨髓炎出现率高，传递不完全，预后相对好。其他病例数较少的基因还包括AD IRF8（T80A）、NEMO、CYBB、TYK2等。MSMD 患儿的BCG 病平均发病年龄为12 个月，较SCID 和CGD 患儿4～5月龄延迟[18]。骨、关节、软组织受累最常见于MSMD 患儿，未见非区域淋巴结受累。大部分具有BCG 病的MSMD 患儿是由矫形儿科医师推荐就诊发现的[30-34]。

体外可用全血细胞在活的BCG、活的BCG 加IFN-γ、活的BCG 加IL-12p70 刺激48 h 后，用ELISA法检测上清液中IL-12p40、IL-12p70、IFN-γ 水平，可判断IL-12/IFN-γ 通路中可能缺陷的具体基因[35]。IL-12B、IL-12RB1、TYK2、SPPL2a、ISG15基因突变导致IFN-γ 分泌缺陷。IFNGR1、IFNGR2、STAT1、CYBB基因突变导致针对IFN-γ 反应缺陷。IRF8和NEMO突变导致IFN-γ 分泌和反应缺陷。IL-12/IFN-γ 轴功能分析仅在特殊实验室有条件开展。

4 伴有PID基础的BCG病的治疗及预后

4.1 SCID

SCID 患儿活动BCG 感染在造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT） 过程中提供HSCT 后感染风险和BCG 炎症反应综合征（BCG-IS），是HSCT 后的可怕并发症，提示HSCT 前根除BCG 感染的重要性。HSCT 前延长抗BCG 治疗可降低HSCT 后BCG 感染风险，但SCID 患儿不能延迟HSCT 直至BCG 感染根除。接种BCG 的SCID 患儿HSCT 前后抗BCG 活动感染和BCG 非症状感染尤其重要。SCID 患儿HSCT 前BCG 感染已恢复或改善，HSCT 后也易出现BCG 感染。具有BCGosis 的SCID 患儿HSCT 后易于出现早发的BCG-IS。HSCT后BCG-IS 的治疗，除积极抗BCG 治疗外，需辅以抗炎治疗（激素或抗细胞因子治疗）。早发（2～16 d）的BCG-IS 主要出现于HLA 相合的供者HSCT 后，其他出现于T 细胞重建同时（CD3+T>500 μL）[36]。

由于BCG 天然对吡嗪酰胺耐药，最常用抗BCG 感染的联合用药为利福平、异烟肼和乙胺丁醇，其他常用辅助药物为喹诺酮类（环丙沙星、左氧氟沙星）、氨基糖苷类（阿米卡星、链霉素）和克拉霉素。低水平的异烟肼抵抗见于BCG 丹麦株（SSI1331）。接种BCG 的SCID 患儿常规单独应用异烟肼预防BCGosis 无效。HSCT 前≥2 联早期抗BCG治疗局部BCG 感染或无BCG 感染的接种BCG 的SCID 患儿，及时HSCT 可避免BCGosis 出现。HSCT前抗BCG 至少6 周，HSCT 后平均12 周（1～31 个月）。有研究建议用更积极的4 联或更多药物治疗PID 患者的BCG 病直至完全恢复，然后继续预防性应用2 联药物，直至HSCT 后达到免疫重建[37]。

4.2 CGD

异烟肼和利福平可成功治疗CGD 患儿的BCGitis。BCGosis 需要增加其他药物治疗。一些CGD 患儿未治疗BCGitis，无患儿出现BCG 感染加重。尽管CGD 患儿未经治疗BCG 感染也可改善，但鉴于有BCGosis 的CGD 患儿10年存活率为34%，有BCG 感染的CGD 患儿的死亡率为50%[22]，笔者建议CGD 患儿若有活动BCG 感染，应该积极行抗BCG 治疗，有助于将BCG 的载量降到最低，防止将来再活化。在移植前具有BCG 感染的CGD 患儿，HSCT 后无BCG 感染复发或出现BCG-IS[22]。

4.3 MSMD

完全性IFNGR 缺陷患者预后极差，无很好方法扩大关键细胞因子通路，积极的长期的抗分枝杆菌治疗很关键，数例患者骨髓移植治愈。部分性常染色体显性IFNGR1 缺陷患者由于残留IFNGR1活性使病灶局限（骨髓炎），对IFN-γ 治疗仍然有反应，IFN-γ 和预防性抗生素可成功治疗感染。IL12B/IL12RB1 缺陷患者保留对IFN-γ 反应性，IFN-γ 治疗有效，首次分枝杆菌感染治愈后，是否需预防用抗生素不清楚，在随访中发现分枝杆菌感染很少再复发[38]。

5 BCG接种益处与疾病风险的权衡

BCG 接种可有效预防儿童严重结核病，如粟粒性肺结核和结核性脑膜炎[39]。中国为结核分枝杆菌感染高流行国家，BCG 的预防作用不可或缺。在很多国家，新生儿BCG 包含在标准的疫苗程序中，鉴定出和使潜在风险儿童避免接种BCG 具有挑战性。新生儿接种前应详细询问家族史。在产前孕妇随访中常规开展疫苗相关并发症的预警。但在中国，SCID 患儿的阳性家族史<10%[40]。将SCID 纳入新生儿筛查，待Trecs 结果出来后再接种BCG 是一种合理的选择。延迟BCG 接种存在出生后错失接种机会使覆盖率下降和在未有BCG 疫苗保护时间段出现可预防疾病的潜在风险。结核性脑膜炎出现年龄为23～49 个月，几个病例出现于6月龄内，中位时间12～24 个月，可见在6月龄内出现BCG 可预防的分枝杆菌病是极其少见的。在结核感染高流行国家，早发现、早治疗和有效隔离活动结核感染的育龄妇女及家庭成员是降低新生儿结核分枝杆菌暴露的关键。更安全有效的BCG 疫苗是一条选择途径，对其的研究已在开展，但是其是否能替代目前普遍应用的减毒BCG，尚需时间来验证。合适的BCG 接种策略需要政府卫生保健部门来制定，既保证接种的覆盖率，又能避免高危人群接种BCG[41]。