A型产气荚膜梭菌致病机理的研究进展

龚紫凤，冶贵生

（青海大学农牧学院，青海 西宁 810016）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，Cp）首次于19世纪末从死于主动脉瘤的尸体中分离到，并由Nuttal和Welch 将其命名为产气荚膜梭状芽孢杆菌，1931年国际联盟卫生组织常设标准委员会称其为产气荚膜菌，随后采用产气荚膜梭菌的名称[1-3]沿用至今。Cp作为一种人畜共患的细菌性条件致病性病原，属于革兰阳性厌氧芽孢致病菌，是细菌性食源性疾病暴发的重要原因之一，已成为美国食源性疾病的第二大细菌性病因。该菌广泛分布于污水、土壤、空气及人和动物的胃肠道，其分泌的细胞外蛋白质毒素，可引起人和动物许多不同的组织毒性及肠毒性疾病。基于该菌主要产生的4 种主要致死性毒素（α、β、ε、ι）可将其分为A～G 7种血清型[4-6]，其中A型菌为危害较严重的毒素型菌。

A 型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringenstype A，CpA）是引起禽类坏死性肠炎和人源食物中毒的常见病原，可导致人体或动物体组织气肿，还能引起家兔、犬、犊牛、羔羊、猪等动物肠毒血症及胃肠道传染性疾病，胃肠内的毒素被吸收进入机体并循环，从而损害其他内部器官[7-10]，严重危害人与动物公共卫生安全及现代禽畜产业的发展。本文以有关CpA病理方面的资料为基础，对CpA致病机理进行归纳，以期为更好地做好Cp感染的防控政策提供参考思路。

1 CpA 的致病性

CpA 是常见的肠道菌群，但一定条件下其分泌的外毒素可致病，可导致多种肠道传染性腹泻疾病。吴立婷等对牛、羊、鸡3种不同来源Cp分离株进行毒力鉴定，结果发现52 株分离株均为CpA[11]，司南等对迁徙候鸟样品进行Cp分离鉴定及特性分析，发现CpA分离率高达90%，表明畜禽Cp 感染多以CpA 为主[12]。CpA 能引起初生仔猪肠毒血症，该病多以春冬季发病较为明显，且多发于出生后2 d～3 d 内的仔猪，严重的甚至导致死亡[13]，严重危害养猪产业的发展。王婧祺等研究发现腹泻源与健康源CpA 存在交叉分布，且呈现一定地理分布特征，表明某种程度上CpA对仔猪腹泻的影响可能与地区环境有关[14]。此外CpA 也是导致牛“猝死症”的主要毒素型菌株，该菌产生的肠毒素也能致牛腹泻，引起牛肠源性毒血症，且较易发于犊牛[15]。近年来山东省多个鸭场和兔场均检测出CpA，但具体感染机制不明，需进一步研究[16-17]。因此，也提醒畜禽养殖业需重视CpA 感染导致的危害。另外王斌等通过对朱鹮感染Cp进行分离鉴定，发现3株分离的菌株均为CpA，证明了CpA 能够感染野生动物[18]。此外，CpA 的致病性与自身分泌的溶血素、毒素有直接关系，吴允正等通过研究多种动物源CpA 的生物学特性，发现羊源CpA 溶血最快，猪源CpA 溶血最慢[19]，表明不同动物源的CpA 毒力不同。基于上述研究，表明CpA 不仅在畜禽中呈现流行感染的状况，还可能感染野生动物。

2 CpA 的致病机理

病原微生物指能够侵入宿主，并导致其出现不同程度病理变化的微生物，其中细菌为危害性较大的病原微生物之一。细菌的致病物质主要包括菌体表面结构、毒素及侵袭性酶，病原菌感染往往会破坏宿主肠道黏膜，最终导致其食物中毒、肠炎、腹泻等疾病，严重危害人和动物的健康发展。CpA 作为Cp 中危害较为严重的致病菌，深入了解其毒性及作用机制对研发该菌的疫苗和制定相应的防控政策具有重要的指导意义。

2.1 CpA 的毒力因子CpA 产生的外毒素可致人和动物的组织中毒和肠道感染。该菌主要产生α 毒素和肠毒素，此外，近年来随着有关CpA 致病性相关报道日渐增多，发现CpA 能够产生其他致死性的毒素，如β2、NetB[20-21]。

2.1.1 α 毒素 α 毒素（Alpha toxin，CPA）分子量约为43 ku，是一种重要的致死性毒素，可产生于所有类型的Cp，但在CpA 中表达水平最高。不同毒素型Cp 产生的α 毒素基因具有部分同源性，且其编码基因均位于染色体[20]。α 毒素又名磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）是CpA 主要的毒力因子，且为引发各类组织或肠道感染疾病最重要也是最关键的致病因子。α 毒素属于多功能性金属酶，其分子结构包括β-折叠组成的膜结合C 结构域和α-螺旋组成的催化N 结构域，C 端和N 端具有不同生物活性，C 端膜结构域具有免疫原性[22]，在α 毒素发挥毒性功能中起到至关重要的作用。Takagishi 等研究发现α 毒素能特异性结合神经节苷脂类糖GM1a，随后促进GM1a 的聚集和酪氨酸激酶A（TrkA）的激活，触发lL-8 的释放，lL-8 通过招募和激活中性粒细胞引起细胞急性炎症[23]，进而导致细胞死亡。该毒素同时含PLC 和鞘磷脂酶活性，对鞘磷脂与磷脂酰胆碱具有水解作用，借助这2 种酶活性可破坏细胞膜结构的完整性，引起细胞裂解，从而表现出毒素的细胞毒性、致死性、溶血活性等[24-25]，这也表明α 毒素在CpA 致病过程中起到关键性作用。

2.1.2 肠毒素（Clostridium perfringens enterotoxin，CPE） CPE 分子量约为35 ku，其基因位于染色体或大的接合质粒上，是一种与人和动物有着密切联系的新型细菌毒素，在Cp 介导的人类食物中毒中起重要作用。CPE 包含一个C 端受体结合结构域，以及一个N 端细胞毒性结构域组成，前者能够与宿主细胞上的claudin 受体结合，后者对通过介导寡聚和膜插入形成孔的过程至关重要[26-27]。CPE 孔的形成能够提高细胞质Ca2+浓度，从而通过Caspase-3 介导的凋亡或肿瘤来触发钙调素和钙蛋白酶依赖的宿主细胞死亡[28-29]。此外，CPE 小复合物聚集后形成一个大的CPE 复合物（CH-1），同时在敏感宿主细胞中也能够形成第二个复合物（CH-2），CH-2 的形成能够诱导封闭蛋白（Occludin）的内化，且CH-2 可介导连接蛋白（Claudin）进入CPE 处理后的细胞胞质[30-31]，这可能会破坏细胞的紧密连接，改变细胞膜的通透性，进而导致宿主腹泻。虽然产CPE 的Cp 较少，但呈CPE+Cp 能够引起人腹泻、食物中毒等胃肠道疾病[32-33]。以上研究表明CPE是导致CpA细菌性食物中毒、呕吐及腹泻的重要原因，且CPE在胃肠道感染中发挥重要作用。2.1.3 β2 毒素 β2 毒素（Beta2 toxin，CPB2）分子量约为28 ku，对细胞具有毒性和致死性，大多数Cp类型都能产生β2 毒素，β2 毒素与β1 无明显氨基酸同源性[21]，且β2 毒素的作用方式和受体相关报道较少，其致病机制尚未明确。研究发现不同类型、来源Cp β2 毒素的基因位置有所不同，CPE 与人源CpA β2 毒素基因位于同一质粒中[34]。最新研究表明，猪源CpA 中β2 毒素基因的表达相比其他动物来源的CpA 高[35]。有资料表明产生β2 毒素的CpA 与仔猪肠出血症息息相关，韩春生等研究发现腹泻仔猪中β2 毒素的检出率为77.1%[36]，Bueschel 等通过研究Cp β2 毒素的试验，发现从患肠炎或腹泻症状的新生仔猪粪便中能够检测到β2 毒素，且阳性率高达91.8%，并且大多数分离株为CpA 株[37]，这可能为进一步深入研究CpA 的流行病学调查坏死性肠炎及样病毒重要的指导意义。

2.1.4 坏死性肠炎B 样毒素（Necrotic enteritis B-like toxin，NetB） NetB是一种33 ku 的单链蛋白，首次分离于CpA 感染的坏死性肠炎病鸡中，在禽类坏死性肠炎中起到关键的致病作用[38]。NetB 与β 毒素的氨基酸序列相似度达38%，属于β 成孔毒素家族一员，其构象与α 溶血素差异较大，形成的空隙也较大，该毒素可破坏细胞质膜形成空洞，造成细胞裂解死亡[39]。与大多数毒素一样，NetB 以单体形式存在，插入细胞膜之前在宿主细胞表面寡聚，纯化的天然NetB 和重组NetB 均对鸡肝癌细胞系LMH 具有细胞毒性，可诱导细胞裂解[38]。

2.2 CpA 与宿主细胞的相互作用CpA 可通过其分泌的毒素侵入宿主细胞，引起宿主细胞损伤、坏死，从而对宿主发挥致病作用。用20 μg/mL β2 毒素处理猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）细胞，24 h 后对细胞的黏附力下降，且变圆，并随β2 毒素浓度的增加细胞的损伤愈发明显[40]。此外，β2 毒素能间接或直接攻击机体的中枢神经系统及外周神经系统[41]，影响宿主的生理活动。周姣等通过测定CpA菌株和CpA β2+毒素携带率，利用CpA（β2+/β2-）分离株培养上清液以腹腔接种小鼠方式进行小鼠毒性试验，结果显示小鼠呈现不同程度临床症状甚至死亡，同时表明CpA 毒性与菌株是否携带β2 毒素，是否来自腹泻或健康仔猪均无直接关系，其毒性可能与宿主肠道环境相关[42]。曾秀等以CpA β2毒素为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术筛选出宿主中与β2 毒素发生相互作用的蛋白，结果显示β2 毒素与半乳糖凝集素-1（LGALS1）具有特异性的相互作用，且该毒素与LGALS1 蛋白C 端的相互作用比其与LGALS1 完整蛋白的作用更强[43]，这种互作调节宿主细胞凋亡。由此可见，β2 毒素对宿主正常生命活动有一定的损害，其作用强度可能与蛋白自身结构有关，但具体作用机制尚未明确，仍需进一步研究。

细胞毒性和溶血性是CpA α 毒素与宿主细胞膜相互作用后膜磷脂水解的结果[44]，为此，体外研究可依据α 毒素溶解红细胞的情况来检测该毒素水解细胞膜磷脂的能力。体内研究表明，α 毒素对膜磷脂的水解能力可因其浓度不同而有差异。低浓度α毒素能够水解部分鞘磷脂和卵磷脂，产生第二信使，触发多种信号通路，导致部分细胞调节因子的分泌不受调控；较高浓度α 毒素可降解大量磷脂分子，进而导致细胞膜崩裂及多数细胞裂解[45]。α 毒素也能与GTP 结合蛋白相互作用激活鞘磷脂代谢系统或经激活甘油磷脂代谢系统，进而发挥其溶血和坏死活性，导致细胞组织感染[46]。此外，α 毒素还可激活MEK/ERK 信号通路产生活性氧，且随着活性氧的积累可造成细胞氧化应激损伤[47]。也有研究表明，α毒素激活MEK/ERK 途径，从而通过刺激ERK1/2 和p38 MAPK 途径，诱导细胞氧化应激和IL-8 的产生[48]，危害机体的正常生命活动。

先前研究表明，CPE 通过改变宿主细胞膜通透性，破坏细胞胶体渗透压的平衡，使细胞裂解死亡[49]。另有报道显示，CPE 可通过胰酶作用切除毒素自身的24 个氨基酸残基，致使其毒性增强，其C 端结合细胞膜受体，N 端发挥细胞毒性作用[50]。携带CPE 的Cp 常见于犬感染，推测CPE 有可能通过动物传播至人。相关研究表明，NetB 诱发细胞死亡的原因是在宿主易感细胞膜中形成了失控的离子通道，从而出现细胞渗透性溶解[51]，这对宿主的感染和发病机制起重要作用。

2.3 CpA 感染与机体免疫应答病原菌的致病力及感染很大可能取决于宿主免疫系统与病原菌的相互作用。李建伟将分离到的2 株CpA 分别命其名为CP1和Cp2，通过Cp1 感染WT 和GPR120-/-小鼠构建气性坏疽模型，结果发现相比于WT 小鼠，GPR120-/-小鼠肌肉组织表达的IL-Iβ 水平显著下降，趋炎因子KC水平显著提高[52]，推测CpA 可通过降低细胞因子的表达，影响宿主免疫系统，进而加重病情或引发疫病。Takehara 等研究表明CpA 通过α 毒素以酶活性依赖的方式抑制成熟中性粒细胞的分化，导致中性粒细胞积聚在邻近血管[53]，从而逃避机体的免疫反应。张元可研究发现CpA 与球虫混合感染肉鸡后，肉鸡空肠隐窝T 淋巴阳性细胞数显著下降[54]，其免疫功能受损。另有研究表明，α 毒素可引起宿主细胞线粒体动力学和相关基因表达的改变，干扰线粒体代谢和呼吸过程，导致细胞应激及整体代谢中断[55]。而线粒体对调节细胞的分化、激活和存活发挥了关键作用，这也提示CpA 有可能通过诱导宿主细胞线粒体功能障碍逃避宿主的免疫应答。

3 小结与展望

大量研究表明CpA 仍是Cp 流行的致病菌，且CpA 还可能与其他病毒存在共感染，其产生的外毒素在宿主感染过程中发挥着极其重要的作用，可引起细胞损伤和死亡[56]，为此应重视对该菌的监测、检测及预防。有资料显示YesM/YesN 信号系统与CpA 毒力基因的表达呈正相关，提示该信号系统一定程度上可增强CpA 的致病性[57]，这将为CpA 感染的防治提供重要研究方向。但目前关于CpA 的致病机理尚未明确。因此，加强CpA 致病机制的研究，为研发该菌疫苗研发和流行病学调查奠定基础。另外，近年来由于滥用抗菌药物，Cp 的耐药性呈逐渐增强的趋势[58]，耐药现象的出现警示人们需合理用药，避免耐药性增长过快，进而更好地预防该菌引起的食物安全及动物卫生问题。