离子交换纯化猪伪狂犬病病毒的免疫原性鉴定

夏伟，宋松林，廉维，王富猛，何玉友，董雅文

（吉林正业生物制品股份有限公司，吉林 吉林 132011）

PRV归属于疱疹病毒科（Herpesviridae）α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)，水痘病毒属(Varicellovirus)的猪疱疹病毒1型(Suid herpesvirus 1)，与其同属的病原还有牛疱疹病毒1型和5型（BHV-1 and BHV-5）、禽传染性喉气管炎（ILTV）、马疱疹病毒1型和4型（EHV-1 and EHV-4）、猫疱疹病毒1型、犬疱疹病毒1型以及绵羊疱疹病毒等。在电子显微镜下，PRV病毒粒子呈圆形或椭圆形外观，含有囊膜的成熟病毒粒子直径150～180 nm。PRV结构的描述如下：与其他种属的疱疹病毒类似，具有核酸和衣壳蛋白组成20面体对称的核衣壳，围绕核衣壳外层的蛋白皮层，囊膜位于病毒粒子的最外层，表面具有呈放射状排列的纤突，PRV只有一个血清型，各分离毒株的毒力强弱不尽相同。PRV对外界环境的抵抗力要强于与其同属的其他成员，在夏季PRV可以在外界环境中存活30d，冬季可以保持感染性长达46d。PRV在4℃条件下可以保存20周，病毒在-18～-35℃条件下效价下降较快，仅可保存12周；在液氮及真空冷冻干燥条件下，可以长期保持感染性；因此病毒培养物最好保存于-70℃以下或真空冷冻干燥条件下。脂溶剂可以使PRV灭活。PRV在低温和常温条件下比较稳定，对高温具有一定的抵抗力，在55℃～60℃可存活30～50min，70℃条件下可存活10～15min，80℃条件下3～5 min可将其灭活。PRV在pH4.0～12.0条件下比较稳定，低温条件下，在pH2.0和pH13.5的极端pH条件可以存活2～4h，高温条件下病毒的存活时间会明显缩短。

伪狂犬病（pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一种发热、脑脊髓炎为主要临床症状的急性传染病。多呈局部暴发流行，成年猪主要表现为隐性感染，妊娠母猪主要表现为流产、弱仔和死胎，保育仔猪主要表现为呼吸道综合征，而14日龄以内的仔猪多以高死亡率为主要特征。处于病毒隐性感染的猪是极其危险的传染源，病毒基因组可因应激等因素重新活化成具有感染性病毒粒子。随着猪伪狂犬病变异毒株的出现，PRV Bartha-K61弱毒活疫苗免疫失败的现象频频发生，给我国养猪业造成巨大经济损失。因此，针对PRV变异毒株的防控技术研究备受关注。猪伪狂犬病灭活疫苗是常用的预防猪伪狂犬病的主要手段之一，本研究主要以离子交换法纯化高压破碎的PRV细胞培养物灭活后制备灭活疫苗，免疫试验猪，检测中和抗体水平以验证PRV变异毒株灭活疫苗的免疫原性，为科学防控PRV变异株对猪群的危害提供科学的理论依据。

1 材料

1.1 病毒液猪伪狂犬病病毒培养液，由吉林正业生物制品股份有限公司保存。

1.2 试验动物5周龄健康仔猪15头，经检测猪伪狂犬病毒核酸与抗体均为阴性，购自吉林某猪场。

1.3 填料型号Q-2填料，购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。

2 方法

2.1 抗原纯化将猪伪狂犬病病毒培养物反复冻融3次，1000转/min，离心10min，方法如下：

2.1.1 反应条件整个纯化过程在无菌的环境中进行。

2.1.2 缓冲液配制缓冲液A:20mmol/L PBS，pH7.0；缓冲液B:20mmol/L，PBS+1mol/L NaCl(电导87ms/cm)。

2.1.3 预装柱根据说明书，将Q-2填料加入到500mL预装柱中。

2.1.4 除杂和洗脱：Q-2流穿，Q-2洗杂，Q-2洗脱。

2.2 鉴定

2.2.1 纯化前后病毒液效价测定将1000转/min离心的猪伪狂犬病病毒原液、Q-2流穿，Q-2洗杂，Q-2洗脱分别进行病毒效价测定。

2.2.2 灭活检验取灭活24h后病毒液，按培养液10%、1%和0.1%（v/v）的比例同步接种于新消化的ST细胞悬液（2×105个/mL），分别接种6孔板，每个稀释度设3孔，2mL/孔，置37℃含5%的CO2培养箱中静置培养120h，再连续盲传2代，同时设正常细胞和病毒对照孔，然后显微镜下观察细胞病变情况。

2.2.3 免疫效果对比试验（1）疫苗制备 将纯化前后的病毒液毒价均调整到1×108.0TCID50/mL，灭活后分别与卡波姆佐剂按1:1（v/v）的比例混合，充分搅拌制成灭活疫苗。

（2）分组 将15头试验猪随机分为3组，每组5头，其中两组为免疫组，一组为对照组。

（3）免疫 用2.2.3疫苗制备中的2种疫苗分别颈部肌肉注射免疫组试验猪，1mL/头，免疫后3周以相同的剂量和方式加强免疫1次，对照组以相同剂量和方法注射生理盐水。

（4）观察 首次免疫后观察14d，观察试验猪疫苗吸收情况、过敏情况，精神状态和食欲等临床症状。

（5）体温测定 免疫后14d内，每天测定各组试验猪直肠体温。

（6）抗体效价测定 加强免疫后2周，免疫组和对照组试验猪一并采血，测定各组血清中和抗体效价。

3 结果

3.1 病毒含量测定检测各阶段的病毒液过滤产物的病毒含量，对1000转/min离心后的病毒原液和Q-2流穿、Q-2洗杂和Q-2洗脱液的病毒效价测定结果表明，病毒原液毒价为1×108.5TCID50/mL、Q-2流穿病毒毒价为1×101.0TCID50/mL、Q-2洗杂病毒效价仅为1×101.5TCID50/mL，Q-2洗脱病毒效价达可达到1×108.0TCID50/mL（见表1）。

表1 纯化各阶段病毒液病毒含量测定

3.2 灭活检验取灭活24h后病毒液，按培养液10%、1%和0.1%（v/v）的比例同步接种于新消化的ST细胞悬液（2×105个/mL），分别接种6孔板，每个稀释度设3孔，2mL/孔，置37℃含5%的CO2培养箱中静置培养120h，再连续盲传2代，同时设正常细胞和病毒对照孔，灭活的病毒液均未出现病变情况（见表2）。

表2 灭活病毒育传后的病变情况

3.3 临床观察将纯化前后的病毒液利用1:2000的β-丙内酯灭活后与卡波姆佐剂体积比1:1分别制备灭活疫苗，免疫试验猪，免疫程序为首次颈部肌肉免疫1mL，间隔21d以相同的途径和剂量进行二次免疫，临床观察表明，未纯化处理的病毒液制备疫苗免疫试验猪，其中1头出现了厌食现象，而纯化的病毒液免疫试验猪未出现任何症状（见表3）。

表3 抗原纯化前后疫苗免疫猪临床观察结果

3.4 体温测定3批次疫苗免疫后14d内，每天测定各组试验猪直肠体温，结果表明，免疫组试验猪与对照组试验猪相比体温无明显差异（见表4）。

表4 疫苗免疫猪后体温测定结果

3.5 抗体效价测定（见表5）

表5 抗原纯化前后疫苗免疫猪抗体水平比较

4 讨论

自从我国出现了PRV变异毒株，PRV Bartha-K61活疫苗在临床猪场免疫失败的现象屡见不鲜，PRV变异毒株感染猪群后给我国养猪业造成巨大经济损失。因此，针对PRV变异株疫苗的研究迫在眉睫，PRV灭活疫苗是防控该病的主要手段之一，已有研究表明，PRV变异毒株灭活疫苗能够给猪群提供免疫保护，制备一种安全高效的PRV变异毒株灭活苗作为防控和净化PRV就显得尤为重要。但是疫苗在临床应用过程中常常出现发热、呼吸困难、四肢无力以及厌食等临床反应，严重者会出现猪死亡，副反应对猪应激大，易继发其他疾病，严重影响猪群正常的生产性能。因此，在疫苗制备过程中去除杂蛋白和血清成分，能够显著降低疫苗对猪的副反应，同时对于疫苗的均质性和稳定性也有显著提高，疫苗保存时间会更长。本研究采用的离子交换法纯化PRV，病毒液经过Q2填料时，根据病毒和其他细胞和血清所带电荷的不同，首先病毒被吸附到Q2填料上，其他杂蛋白未被吸附而流穿，然后将吸附到Q2填料上的病毒进行洗脱和除盐，用于后续疫苗的制备，该方法比离心和过滤等方法更能有效去除杂蛋白。离心和过滤不能除掉血清成分和微小的细胞碎片。而该方法能够有效去除疫苗半成品中的杂蛋白。本研究制备的纯化PRV灭活疫苗接种试验猪未见临床过敏反应，并且产生的中和抗体与未纯化试验组未见显著差异，因此，随着疫苗生产工艺不断改进，病毒纯化是疫苗生产工艺中一个非常重要的关键环节，已被我国动物生物制品企业高度重视，为做出世界一流的动物生物制品迈出了关键性一步。