固相萃取/超高效液相色谱－串联质谱法测定儿童化妆品中新康唑等4种抗生素

汪 毅，聂明霞，贾 芳，梁文耀，李鑫宇，文嘉林，夏泽敏，谭建华

（广州质量监督检测研究院，国家化妆品质量检验检测中心，广东 广州 511447）

近年来，关于儿童化妆品中激素、抗生素等药物非法添加的报道频出，儿童化妆品的质量安全问题已成为大众的关注焦点。相关研究表明，不规范使用抗生素类药物容易造成过敏性皮炎、肝功能损伤等不良影响，并使人体产生耐药性［1－3］，其中儿童是抗生素滥用中的最大受害者［4－6］。笔者在使用高分辨质谱筛查化妆品中禁用物质的日常工作中发现，市场上一些儿童化妆品（主要是婴幼儿护肤膏）存在新康唑等抗生素非法添加情况。新康唑等并不在此前的一些化妆品相关规范和标准［7］规定的抗生素检验方法范围内，虽然目前一些药物或土壤中此类化合物的测定方法已有文献报道［8－9］，但化妆品与这些基质差异较大，已有方法无法直接应用于化妆品中相关化合物的测定。因此亟需建立高灵敏、快速且能同时分析新康唑等多种组分的测定方法［10］，为相关监管工作提供技术支撑。

液相色谱－质谱联用技术是抗生素分析检测的有效技术手段［11－13］，但由于许多样品在分析过程中存在基质抑制现象，因此需要进一步净化。新康唑、硫康唑、抑霉唑、噻康唑是咪唑类衍生物［14］，脂溶性较强，且此类化合物咪唑环上的吡啶N碱性较强，因此本文使用强阳离子交换SPE小柱去除杂质，消除基质抑制，使目标物获得了良好回收率。本文建立的化妆品中新康唑等4种禁用物质［7］的超高效液相色谱－串联质谱检测方法，将有效填补抗生素检验方法的缺口，对保障消费者特别是儿童群体的权益和健康具有重大意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津液相色谱仪－SCIEX AB 5500+三重四极杆质谱仪（日本岛津与美国SCIEX公司）；BSA224SCW电子天平（德国赛多利斯公司）；MS3 basic涡旋振荡器（德国IKA公司）；KQ－250DV型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli－Q纯水系统（美国Millipore公司）；固相萃取系统（上海安谱科学仪器有限公司）；强阳离子交换小柱（200 mg，3 mL，上海安谱科学仪器有限公司）。

抑霉唑（纯度99.2%，CAS：35554－44－0，美国Dr.Ehrenstorfer公司）；新康唑（纯度98.0%，CAS：67914－69－6）、噻康唑（纯度99.1%，CAS：65899－73－2）（美国CATO公司）；硫康唑（纯度95.0%，CAS：61318－90－9，美国Aladdin公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（分析纯，上海安谱科学仪器有限公司）；实验用水（18.2 MΩ·cm）由Milli－Q纯水系统制备。

1.2 标准溶液的配制

分别精密称取4种对照品10 mg，使用乙腈溶解，配制成质量浓度1 mg/mL的标准储备溶液，4℃保存。分别取适量标准储备溶液用70%乙腈稀释，配制成10 mg/L的标准中间液。取适量标准中间液，用70%乙腈稀释成0.1、0.2、0.5、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列标准混合溶液。

1.3 样品前处理

称取样品0.2 g（精确至0.001 g）于10 mL具塞比色管中，加入2 mL 70%乙腈水溶液（甲酸调至pH 3.0），涡旋30 s使样品分散，再定容至刻度，涡旋30 s后，超声提取15 min。取样液6 mL于10 mL塑料离心管中，6 500 r/min离心10 min。

取强阳离子交换固相萃取小柱，分别用5 mL甲醇和10 mL超纯水活化，取离心上清液4 mL加入固相萃取柱，使其自然流下，用4 mL 2%甲酸水淋洗柱床后，再用4 mL含10%异丙醇的乙腈溶液淋洗柱床，洗耳球挤干后用4 mL含10%异丙醇的乙腈溶液（含2%氨水）洗脱目标物，收集流出液，过0.22 μm滤膜后待测。

1.4 仪器分析条件

色谱条件：Waters ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相：A相：0.1%甲酸水，B相：乙腈；流速：0.3 mL/min；进样量：3 μL；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～7 min，20%～50%B；7～9 min，50%B；9～9.1 min，50%～90%B；9.1～12 min，90%B。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI源）；监测模式为正离子多反应监测（MRM）；离子化电压4 500 V；气帘气压力137.8 kPa；喷雾气压力344.7 kPa；碰撞气压力62.1 kPa；离子源温度450℃；监测离子对、碰撞电压（CE）和去簇电压（DP）等参数见表1。

表1 4种抗生素的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 4 antibiotics

2 结果与讨论

2.1 方法建立

2.1.1 色谱柱的选择4种抗生素的logP值在3.58～5.66之间，在C18色谱柱上均有较好的保留，因此考察了Waters ACQUITY HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）、Agilent Poroshell 120 SB C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Phenomenex Kintext C18（3 mm×100 mm，2.6 μm）几种不同品牌规格的C18色谱柱对化合物的分析效果。结果显示各化合物在不同的C18色谱柱上均能得到有效分离，且在Waters ACQUITY BEH C18柱上的峰形更加尖锐对称，因此用该柱进行后续分析。

2.1.2 流动相的选择比较了水－乙腈、水－甲醇两种流动相体系对4种抗生素的色谱分离效果。结果显示，水－乙腈体系的洗脱能力更强，峰形更加尖锐。比较了10 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸两种不同流动相添加剂对色谱峰的影响，发现流动相中添加0.1%的甲酸时，能通过降低pH值使化合物离子化，有效提高化合物的响应强度。因此，确定0.1%甲酸水－乙腈作为流动相。

2.1.3 质谱条件的优化在MS Only模式下，将200 μg/L的混合标准溶液通过针泵注入质谱。调整质谱条件和扫描模式，获取化合物的母离子和子离子信息。在负离子模式下，4种化合物均无信号，而在正离子模式下能获得信号强度较高的母离子。这是因为咪唑环上的吡啶N碱性较强，极易结合H+带正电，因此使用正离子模式进行分析。通过优化碰撞能、去簇电压和离子源温度等参数，获得强度较高且稳定的化合物响应。

设置400、450、500、550℃4个离子源温度，在正离子模式下对混合标准溶液进行分析，温度升至450℃后，新康唑的信号强度有所降低，其他3种化合物响应强度几乎无变化。因此，离子源温度设置为450℃。

2.2 前处理方法优化

2.2.1 提取溶剂的选择乙腈水溶液对化妆品具有较好的分散、提取效果，通常用于化妆品中各类激素等物质的测定［2，8］。本文以乙腈水溶液为提取溶剂，并比较了不同乙腈含量（10%、20%、30%、40%、50%、70%、90%）对4种抗生素的提取效果。如图1所示，随着乙腈含量从10%升高到90%，新康唑、硫康唑和噻康唑的回收率逐渐升高后降低：乙腈含量大于30%后化合物的回收率超过70%，当乙腈含量达到90%后，部分目标物的回收率低于20%；抑霉唑在各含量提取溶剂中的回收率均低于70%，达不到分析要求。可能原因是目标化合物脂溶性较强，使用高含量有机溶剂提取时，存在大量的防腐剂、表面活性剂等共提物，影响了目标物的离子化效率，产生严重的基质效应。为此，本研究进一步对基质效应进行确认。选取一阴性膏霜样品0.2 g，使用10 mL 70%乙腈水超声提取15 min，离心后取上清液加入一定体积的混合标准溶液（各目标物最终质量浓度为10 μg/L），将相同浓度的溶剂混合标准溶液和基质标准溶液上机分析。以基质标液中化合物响应值/溶剂标液中化合物响应值计算基质效应。实验结果显示，新康唑、硫康唑、抑霉唑、噻康唑的基质效应分别为0.52、0.51、0.95、0.64，即化合物受到不同程度的基质抑制。因此需要进一步对70%乙腈水提取的样品进行净化处理以获得符合分析要求的回收率。

图1 4种抗生素在不同含量乙腈中的提取回收率Fig.1 Extraction recoveries of 4 antibiotics in different proportions of acetonitrile

2.2.2 固相萃取小柱的选择HLB固相萃取小柱的基质是含有亲脂性二乙烯苯的大孔共聚物，在pH 1.0～14.0范围内非常稳定，对非极性至中等极性的酸性、中性、碱性化合物均有较好的回收率，适用范围广。考虑到目标化合物的脂溶性和弱碱性，使用HLB小柱对样品进行净化，将净化后的样液上机分析。结果显示，新康唑的回收率低于50%，可能是因为HLB小柱不能将目标物与杂质分离，未能有效消除基质效应。同时，由于HLB小柱对目标物的反相保留太强，导致部分目标物难以从柱上完全洗脱，影响回收率，因此HLB小柱不适合用于4种抗生素的净化。

SCX小柱的官能团为苯磺酸，提取目标物时磺酸基团显示阳离子交换性质，而苯环显示非极性吸附性质。新康唑、硫康唑、抑霉唑、噻康唑为弱碱性化合物，pKa值分别为6.88、6.55、6.53和6.66，当溶液的pH值小于4.0时，化合物能够完全离子化，与苯磺酸根结合，在柱上保留，用中性溶剂淋洗小柱即能去除中性和酸性共提物，达到净化作用。因此使用SCX小柱净化样品。将净化后的样液上机测试，结果如图2所示。经SCX小柱净化后，目标化合物的回收率较未净化样品显著提高，新康唑的回收率更是从54.1%上升至96.3%。SCX小柱能有效净化样品，使化合物回收率满足方法需求，因此选择SCX小柱做进一步方法优化。

图2 4种抗生素使用不同固相萃取小柱净化后的提取回收率Fig.2 Extraction recoveries of 4 antibiotics purified with different solid phase extraction cartridges

2.2.3 洗脱溶剂的选择采用4 mL含2%氨水的乙腈溶液对淋洗后的柱床进行洗脱，收集洗脱液上机测试。结果显示新康唑、抑霉唑和噻康唑的回收率良好，硫康唑的回收率为75%，相对较低。继续对柱床洗脱，第5 mL的洗脱溶液中仍有硫康唑检出。可能是由于SXC小柱有阳离子交换和非极性吸附双重作用，使得logP值较高的硫康唑难以洗脱，因此应选择极性更低的洗脱溶液。使用4 mL含10%异丙醇的乙腈（2%氨水）溶液洗脱目标物，收集洗脱液上机测试，发现硫康唑的回收率提高至80%以上，因此选择该溶剂为洗脱溶剂。

2.3 线性关系、检出限及定量下限

配制系列混合标准溶液进行测定，以目标物的峰面积（Y）对相应的质量浓度（X，μg/L）进行线性回归，得到各化合物的标准曲线方程。结果表明4种抗生素在其质量浓度范围内线性良好，相关系数（r）均为0.999。以3倍信噪比计算方法检出限（LOD），以10倍信噪比计算方法定量下限（LOQ），得到4种抗生素的LOD和LOQ分别为0.005～0.250 μg/g和0.010～0.500 μg/g（表2）。结果表明，4种抗生素的线性关系良好，方法的检出限和定量下限均可满足化妆品的检测需要。

表2 4种抗生素的线性关系、检出限和定量下限Table 2 Linear relationships，LODs and LOQs of 4 antibiotics

2.4 回收率及相对标准偏差

选取3种典型化妆品（水、乳液、膏霜）作为加标基质，分别按照1倍、2倍和10倍定量下限进行低、中、高3个浓度水平的加标回收实验，按照本方法进行前处理和测定，每个浓度水平平行测定6次，计算得到4种抗生素的平均回收率为89.3%～113%，相对标准偏差（RSD）为0.90%～7.2%（表3），满足准确度和精密度要求。

表3 4种抗生素的回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 4 antibiotics（n=6）

2.5 实际样品测定

对市面上销售的100多个批次的水、乳、膏霜使用上述方法进行测定，结果在4个批次产品中检测出新康唑，含量范围为0.24～1.25×104mg/kg，主要为儿童护臀霜产品。图3为阳性样品谱图。

图3 新康唑阳性样品的提取离子色谱图Fig.3 Extraction ion chromatogram of an elubiol positive sample

3 结论

通过优化前处理条件和仪器方法建立了测定儿童化妆品中新康唑等4种抗生素的固相萃取/超高效液相色谱－串联质谱法，基于该类化合物咪唑环上吡啶N有较强碱性的特点，用强阳离子交换SPE小柱去除共提物，获得了较好回收率。该方法高效、准确、特异性好，能够为化妆品相关质量监管提供有效的技术支持。目前，虽然新康唑在儿童化妆品中存在非法添加事实，但缺少相关检出情况的报告及检验方法，还处于监管盲区。在此呼吁相关监管部门扩大儿童化妆品中抗生素的监测范围，防止不法分子利用监管漏洞非法牟利，危害儿童健康。