HPLC－MS/MS法测定婴幼儿果蔬米粉中17种新烟碱类杀虫剂及代谢物

郭礼强，刘永强，王 乐，李 凯，徐晓杰

（1．潍坊海关，山东 潍坊 261041；2．济南海关技术中心，山东 济南 250014）

新烟碱类杀虫剂目前占据全球杀虫剂市场的25%［1］，使用后约有20%会被植物吸收利用［2－4］，能够以原药或代谢产物形态在植物果实内积累［5－6］。Craddock等［7］报道美国农业部1999～2015年间监控的食品和水中新烟碱类杀虫剂的检出率高达4.5%，其中5%的果蔬样本中同时检出2种新烟碱类杀虫剂。Chen等［8］调查发现所有水果及蔬菜样本（油桃及番茄除外）及90%的蜂蜜样本中至少检出1种新烟碱类杀虫剂，72%的水果、45%的蔬菜和50%的蜂蜜样品中至少含有2种新烟碱类杀虫剂，甚至在植物样本中检测到其代谢物（如烯式吡虫啉或羟基吡虫啉）［9］。婴幼儿食用残留有新烟碱类杀虫剂的米粉会对身体产生不利影响，Keil等［10］报道吡虫啉可使婴儿患自闭症的几率增加2倍，Carmichael等［11］报道孕妇在怀孕早期暴露于新烟碱类杀虫剂与新生儿特定心脏缺陷表型有一定关联，余晋霞等［12］研究发现新烟碱类杀虫剂影响儿童体内的性激素水平。婴幼儿果蔬米粉主要原料为大米或小米、水果和蔬菜等，易残留新烟碱类杀虫剂，而关于婴幼儿米粉中新烟碱类杀虫剂的检测方法较少，涵盖种类不足，因此非常有必要开发一种简便、快速、全面的婴幼儿米粉中新烟碱类杀虫剂残留的检测方法，以保护婴幼儿身体健康。

当前新烟碱类杀虫剂的检测方法主要为液相色谱法［13－15］和高效液相色谱－串联质谱法（HPLCMS/MS）［16－18］，但研究种类少，研究基质多为谷物、蔬菜、土壤、水果和蜂蜜等初级原料，而关于基质更复杂危害更大的婴幼儿食品则鲜有报道。相较于液相色谱法，HPLC－MS/MS法的灵敏度好，检测通量高，定性定量准确，本文基于QuEChERS净化技术，选取婴幼儿代表性辅食米粉为研究基质，建立了同时测定婴幼儿果蔬米粉中17种新烟碱类杀虫剂及其代谢物残留的HPLC－MS/MS法，可为婴幼儿辅食中新烟碱类杀虫剂的综合性评估提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LCMS8045液相色谱－串联质谱仪（日本岛津公司）；N-EVAP111氮吹仪（美国Organomation公司）；MS3涡混振荡器（德国艾卡公司）；KQ－500E数控超声清洗器（昆山市超声仪器公司）。

标准品：吡虫啉、环氧虫啶、噻虫嗪、噻虫胺和氟啶虫酰胺购于Dr.Ehrenstorfer公司；烯啶虫胺和氟啶虫胺腈购于CATO公司；啶虫脒、去甲基啶虫脒、噻虫啉、氯噻啉、去甲基噻虫胺和呋虫胺购于坛墨公司；5-羟基吡虫啉、呋虫胺代谢物DN、呋虫胺代谢物UF和氟啶虫酰胺代谢物TFNG购于阿尔塔公司。石墨炭黑粉（GCB）、C18粉、N-丙基乙二胺（PSA粉）、氨丙基粉（NH2）和Captiva EMR－Lipid（EMR）粉购于美国安捷伦公司；分子筛（MS）购于南京先丰纳米科技公司；超纯多壁碳纳米管（CNT）购于苏州碳丰科技公司；甲醇、甲酸、乙腈和乙酸乙酯均为色谱纯（美国Thermo Fisher公司）；实验用水为自制超纯水。

标准品储备液：17种标准物质分别用乙腈配制质量浓度为100 mg/L的标准品储备液，于-18℃冰箱保存。混合标准中间液：分别取100 μL各标准品储备液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制质量浓度为1 mg/L的混合标准中间液。

定容液：1 mL甲酸、800 mL去离子水和200 mL乙腈混匀即得。

1.2 分析条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A为0.1%（体积分数）甲酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱：0～0.1 min，20%B；0.1～3.5 min，20%～45%B；3.5～5.0 min，45%～75%B；5.0～7.5 min，75%～20%B；7.5～10 min，20%B。柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：10 μL。

1.2.2 质谱条件多反应监测（MRM）模式：电喷雾电离源正离子扫描（ESI+）；碰撞气：氩气；加热气：空气，流速为9.5 L/min；干燥气：氮气，流速为9.5 L/min；雾化气：氮气，流速为3.5 L/min；DL温度：255℃；接口温度：350℃。

1.2.3 提取方法准确称量5.0 g米粉样品，转移至50 mL离心管中，加入5 mL水润湿样品，静置10 min。依次加入1 g无水MgSO4和20 mL含1%（体积分数）甲酸的乙腈后涡旋30 s，超声20 min，以5 000 r/min离心10 min。转移10 mL上清液至玻璃管中氮气吹干，加入50 mg PSA、20 mg C18和1 mL定容液，涡旋1 min，取溶液经0.22 μm滤膜过滤，待测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

用定容液将17种新烟碱类杀虫剂及代谢物的标准储备液稀释为1 mg/L，以自动进样器分别进样，通过质谱扫描发现，17种目标物在正离子模式下的响应值均比负离子模式下高5倍以上。因此，在正离子模式下全扫描确定各目标物的母离子，进一步通过子离子扫描确定响应值最高的2个子离子。通过软件自动优化模式进一步精确优化各化合物的母离子、子离子和碰撞能量，选择响应值最高的子离子作为定量离子，响应值次高的子离子为定性离子，17种目标物的部分质谱参数见表1。

表1 17种新烟碱类杀虫剂及代谢物的质谱参数Table 1 MS parameters of 17 neonicotinoid pesticides and their metabolites

2.2 色谱条件的优化

本实验以0.1%甲酸水溶液－甲醇为流动相时，烯啶虫胺、呋虫胺和环氧虫啶的色谱图出现扁平峰，响应值低，峰形不理想；将有机相改为乙腈时，峰形得到改善，进一步提高甲酸比例为0.2%时，多数新烟碱类杀虫剂的响应值提高，而DN、UF和TFNG等代谢物的响应值变差。综合考虑，确定以0.1%甲酸水溶液－乙腈为流动相，17种新烟碱类杀虫剂及代谢物的色谱峰形比较理想，定量离子色谱图见图1。

图1 17种新烟碱类杀虫剂及代谢物的色谱图（0.5 μg/L）Fig.1 Chromatograms of 17 neonicotinoid pesticides and their metabolites（0.5 μg/L）the peak numbers of 1－17 denoted were the same as those in Table 1

2.3 提取方法的优化

以胡萝卜米粉为基质（加标浓度10 μg/kg），比较了甲醇［19］、乙腈［20－21］和乙酸乙酯对17种新烟碱类杀虫剂及代谢物的提取回收率。结果显示，以甲醇为提取溶剂时，提取液残留有较多杂质，导致质谱背景噪音大；以乙酸乙酯为提取溶剂时回收率最低，并携带较多色素；以乙腈为提取溶剂时回收率最高，17种目标物的回收率为27.4%～50.8%。由于在酸性条件下，5-羟基吡虫啉和去甲基啶虫脒等代谢物更稳定不易分解，所有目标物的回收率均可提高5.1%以上，最终确定提取溶剂为含1%甲酸的乙腈。新烟碱类杀虫剂的内吸性好［22］，主要残留在果实内部，实验发现，先加水润湿样品可以促进乙腈对样品中目标物的提取，但部分杂质会进入乙腈提取液，而通过加入无水硫酸镁可使乙腈和水分层减少杂质的引入。实验进一步对比了振荡和超声2种提取方法对目标物回收率的影响，结果显示振荡提取的回收率低于超声提取，且超声提取20 min可达到提取效果。实验最终确定以含1%甲酸的乙腈为溶剂，加无水硫酸镁后超声提取，具体见“1.2.3”，17种目标物的回收率为39.0%～71.6%。

2.4 净化方式的选择

果蔬米粉基质复杂，本文采用QuEChERS净化方法［21－22］，考察了GCB、C18、PSA、NH2、EMR粉、CNT和MS 7种净化剂对17种目标物的回收率，10 μg/kg的混合标准溶液中分别添加50 mg净化剂后经质谱检测，回收率结果见图2。实验发现GCB、CNT和MS对多数新烟碱类杀虫剂的吸附非常严重，EMR粉对吡虫啉、噻虫啉和氟啶虫胺腈等也有较严重的吸附，C18、PSA和NH2对17种目标物的吸附影响较小。C18可以有效去除米粉样品中的胆固醇、甾醇、维生素等干扰物，而PSA和NH2类似，能有效去除样品溶液中的极性基质（如脂肪酸、色素、糖类等）。通过实验对比发现PSA吸附色素的效果比NH2好，因此选择C18和PSA作为净化剂。

图2 不同净化剂对17种新烟碱类杀虫剂及代谢物的回收率Fig.2 Recoveries of 17 neonicotinoid pesticides and their metabolites by different purification agents

2.5 基质效应

分别在空白样品基质中添加2、5、10、20 ng/mL的混合标准溶液，采用本方法进行测定，以基质效应抑制率评价17种目标物的基质效应。基质效应抑制率=（溶剂中标准物质的定量离子响应强度-样品基质中标准物质的定量离子响应强度）×100%/溶剂中标准物质的定量离子响应强度［23－24］。抑制率越接近0，表明基质效应越小，反之越大；抑制率为正值，表明存在基质抑制效应，负值则为基质增强效应。17种目标物在水果米粉（香蕉苹果味）中的基质效应抑制率为11.4%～47.1%，蔬菜米粉（胡萝卜菠菜味）中的基质效应抑制率为10.7%～44.8%，说明均存在不同程度的基质抑制效应。为减少不同基质对实际样品检测结果的影响，采用空白基质溶液配制标准曲线进行外标法校正。

2.6 线性关系、检出限与定量下限

由“2.5”结果可知，水果米粉和蔬菜米粉的基质效应相差不大，本文选取蔬菜米粉基质空白提取溶液配制17种目标物的系列标准溶液，质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L。分别以各目标物质谱峰面积的平均值（Y）为纵坐标，对应质量浓度（X，μg/L）为横坐标绘制标准曲线，并分别以3倍和10倍信噪比（S/N）确定方法的检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。由表2可见，17种目标物在对应的质量浓度范围内线性良好，相关系数（r）均大于0.995 4，LOD为0.02～0.15 μg/kg，LOQ为0.06～0.50 μg/kg，表明方法具有较高的灵敏度。

表2 17种目标物的线性关系、检出限及定量下限（n=6）Table 2 Linear relations，limits of detection and limits of quantitation for 17 analytes（n=6）

2.7 回收率与相对标准偏差

在水果和蔬菜米粉空白样品中添加17种目标物的混合标准溶液，加标水平为LOQ、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg，采用本方法进行检测，每个水平重复6次。由表3可见，3个加标水平下，17种目标物在水果米粉中的平均回收率为62.5%～103%，相对标准偏差（RSD）为3.5%～17%；蔬菜米粉中的平均回收率为66.4%～108%，RSD为4.3%～13%，表明该方法的准确度高、精密度好。

表3 17种目标物在米粉样品中的平均回收率及相对标准偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and RSDs of 17 analytes in spiked rice flour samples（n=6）

2.8 实际样品检测

采用本方法对10份果蔬米粉样品进行检测，在1份蔬菜米粉样品中检出啶虫脒，含量为7.4 μg/kg。目前国家标准GB 2763－2021［25］尚未规定婴幼儿果蔬米粉中新烟碱类杀虫剂的最大残留限量，由于婴幼儿对其更敏感，建议国家尽快发布相关限量标准，以保护婴幼儿身体健康。

3 结论

本文以易污染新烟碱类杀虫剂残留的婴幼儿果蔬米粉为研究对象，C18和PSA为净化剂，基于QuEChERS法，建立了高效液相色谱－串联质谱快速测定婴幼儿果蔬米粉中17种新烟碱类杀虫剂及代谢物残留的检测方法。该方法灵敏、准确，可用于对婴幼儿果蔬米粉中新烟碱类杀虫剂残留的监管检测。