烟草两种质源胞质雄性不育系生化特性比较

彭坚强，陈学军，吴兴富*，焦芳婵，冯智宇，杨大海，张谊寒，刘天彦，杨林明

(1 云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650021； 2 云南省烟草公司保山市公司，云南 保山 678000；3 云南省烟草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000)

烟草是重要的经济作物，利用雄性不育系配制杂交种已得到广泛应用，不育系杂交种种植面积占全国烟草面积的50%以上[1]。我国烟叶主产区主栽品种所用的不育系胞质，均来源于野生种Nicotianasuaveolen(以(sua)S表示，下同)。近年来，通过细胞融合并辅助以流式细胞术筛选等手段，获得了源自N.glauca(以(gla)S表示，下同)等材料的不育胞质[2-4]。不同来源的烟草不育胞质，其配合力、败育特点及胞质效应不同。开展烟草不同来源胞质雄性不育系生化特性的机理研究，对不同来源胞质雄性不育系杂交种的应用尤为重要。烟草细胞质雄性不育系(CMS)是烟草遗传育种的重要材料，对不育机理的研究主要集中在细胞膜系统和能量代谢关键酶活性的比较方面。细胞膜对细胞具有保护作用，当细胞膜受到损伤或破坏时，细胞的生物学功能将受到影响甚至丧失[5]。前人研究认为，超氧化物歧化酶(SOD)的主要功能是清除生物体内的超氧离子基团，使生物体内过多的氧转变成为H2O2，过氧化物酶(POD)能清除植物体内产生的有毒H2O2。作为生物体内主要的活性氧防御酶，SOD和POD协同维持体内的活性氧代谢平衡，保护生物膜结构[6-7]。

关于(gla)S与(sua)S两种来源的不育系与其保持系，其主要生育期叶片中POD及SOD酶活性变化特点，以及盛花期叶片及花蕾POD、SOD酶活性、ATP含量等鲜有报道。本文研究了(gla)S、(sua)S及其保持系MF K326主要生育期POD酶和SOD酶活性和盛花期POD酶、SOD酶活性以及ATP和ADP含量，为进一步探讨烟草胞质不育系机理，多途径挖掘和创制雄性不育新胞质源及在育种上的利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

Nta(gla)S K326(以(gla)S表示，下同)胞质是经体细胞杂交并以K326为父本回交10代获得的不育系胞质[3]，Nta(sua)S K326胞质(以(sua)S表示，下同)和保持系K326(以MF K326表示，下同)由中国烟草育种研究(南方)中心提供。

1.2 取样方法

在烟株成苗期、团棵期、旺长期、现蕾期及盛花期取供试材料中部叶片进行POD活性及SOD活性的测定。在盛花期，取花蕾及中部叶片进行POD、SOD活性及ATP、ADP含量测定。

1.3 POD及SOD活性测定

用索莱宝公司的检测试剂盒测定POD及SOD的活性，测定方法分别为愈创木酚法和黄嘌呤氧化酶法。

1.4 ATP及ADP含量测定

称取2 g样品迅速放入液氮中研磨成粉末，尽量研磨细一点。加入10 mL 0.6 mol/L的HClO4到磨细的样品中，混匀后置于冰上1 min。将上述混合液在4 ℃，6 000×g离心10 min。吸取上清液(约6 mL)，用1 mol/L的KOH中和其pH至6.5～6.8，上清液置于冰上30 min，以将形成的高氯酸钾沉淀下来。用滤纸将沉淀物过滤掉，然后再用0.25 μm的滤膜过滤1次。 此步骤可选择在4 ℃，6 000×g离心5 min代替。最终得到约8 mL的过滤液(离心液)，将其贮存在-30 ℃用于测定分析[8]。

1.5 数据处理

采用DPS方差分析软件和Excel进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 两种质源胞质不育系及保持系主要生育期POD及SOD活性

测定结果表明(表1)，在烟叶主要生育期，供试材料SOD活性呈先增强后降低趋势，团棵期活性最强。数据分析表明，成苗期、团棵期供试材料3者间无显著差异；旺长期、现蕾期、盛花期(gla)S、(sua)S与MF K326存在显著差异。POD活性呈现升—降—升的趋势，烟株团棵期活性最强。数据分析表明，成苗期(gla)S同MF K326无显著差异，(sua)S同MF K326存在显著差异；团棵期、旺长期、现蕾期(gla)S、(sua)S与MF K326存在显著差异，(gla)S与(sua)S间也存在显著差异；盛花期(gla)S、(sua)S与MF K326存在显著差异。

表1 两种质源胞质不育系及保持系主要生育期POD及SOD活性

2.2 盛花期叶片及花蕾ATP、ADP含量及POD、SOD活性

2.2.1 ATP及ADP含量

由图1可知，花蕾组织中，(gla)S的ATP+ADP总量仅比MF K326的减少2.86%，而(sua)S的ATP+ADP总量比MF K326的减少20.86%。叶片组织中，(gla)S的ATP+ADP总量比MF K326的减少35.03%，而(sua)S的ATP+ADP总量比MF K326的减少74.52%。花蕾组织中，MF K326的ATP含量是其ADP的2.02倍，(gla)S的ATP含量是其ADP含量的1.19倍，(sua)S的为1.39倍。叶片组织中，MF K326的ATP含量是其ADP的1.72倍，(gla)S的ATP含量是其ADP含量的1.27倍，(sua)S的为1.56倍。盛花期(gla)S的叶片及花蕾组织中，其ATP及ADP含量均高于(sua)S不育系胞质。

图1 两种质源不育系胞质及其保持系花蕾与叶片中ATP及ADP含量Fig.1 ATP and ADP measurements in leaf and floral buds from (gla)S，(sua)S and MF K326

2.2.2 POD及SOD活性比较

由图2可知，盛花期叶片样品的MF K326的POD活性显著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S间无显著差异；花蕾中，MF K326的POD活性显著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S间无显著差异。

图2 盛花期POD活性比较Fig.2 Enzyme enzyme activity of SOD at the flowering stage

SOD酶活性测定结果表明(图3)，盛花期叶片样品的SOD活性MF K326、(gla)S、(sua)S三者无显著差异；花蕾中MF K326的SOD活性显著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S无显著差异。

图3 盛花期SOD活性比较Fig.3 Enzyme enzyme activity of SOD at the flowering stage

3 讨论

ATP是促进植物细胞内各物质合成的直接能源，ATP含量降低，植物体内各种生物大分子合成会受阻或减少。玉米、高粱、水稻等作物中报道，ATP含量在不育系中显著的降低。Bergman[9]研究了烟草Nta(rep)S不育系与其保持系花蕾组织ATP与ADP的含量，发现不育系的ATP与ADP的含量显著低于保持系。本研究对两种质源不育系盛花期的叶片与花蕾ATP与ADP含量测定结果表明，保持系叶片及花蕾的ATP含量显著高于供试的两种不育系胞质，说明在供试两种不育系的花器官生长发育过程中由于ATP含量下降，可能会使烟株体内生物大分子合成受阻或减少，这也可能是导致供试两种不育系花粉败育的一个原因。

POD是一种具有多种生理功能的酶，可以氧化自由基吲哚乙酸和催化多种反应等。发育正常的植株，其体内POD酶活性维持一定水平以去除活性氧，使植物体内的POD与活性氧维持一定的平衡[10]。SOD能够清除植物体内的超氧自由基，是植物重要的抗氧化物保护酶。本研究对主要生育期叶片POD和SOD酶活性测定表明，MF K326与(gla)S、(sua)S的POD及SOD酶活性均在团棵期达到最高值；在全生育期，MF K326的POD及SOD酶活性也均高于两种不育胞质。盛花期叶片与花蕾组织中POD及SOD酶活性测定结果表明，叶片及花蕾组织MF K326的POD及SOD酶活性也高于(gla)S及(sua)S不育胞质。本研究表明，供试两种不育胞质POD酶活性降低，可能会使烟株体内的POD与活性氧失去平衡，而SOD酶活性的降低可能会使植物体内产生的超氧自由基不能及时清除，酶活性的改变可能会引起膜质不稳定从而出现不育。这在烟草(sua)S不育系花蕾[11-12]、小麦[5]、水稻[13]、玉米[14]等作物不育系研究中均有报道。另外，本研究对(gla)S和(sua)S花柱比较发现，(gla)S的花柱和保持系一样，柱头为两瓣，而(sua)S则以3瓣和4瓣为主，花柱有畸形等。这种现象是否与(gla)S胞质较高的ATP含量、SOD酶活性高于(sua)S等有关，尚待下一步开展基于基因组学、代谢组学为基础的相关研究予以阐明。

4 结论

烟草两种质源胞质雄性不育系同保持系之间在盛花期POD、SOD酶活性及ATP、ADP含量发生明显变化，MF K326的POD及SOD酶活性均显著高于(gla)S及(sua)S，ATP、ADP含量显著高于(gla)S及(sua)S。盛花期是种子形成的关键时期，酶活性的降低和ATP、ADP含量下降是导致(gla)S及(sua)S不育的重要因素。本研究为进一步开展胞质不育系机理研究及杂种优势利用提供了基础。