肉桂精油香氛抗菌活性及成分分析

于泓鹏，邹金池，吴克刚,2*，柴向华，段雪娟，何东,2

（1.广东工业大学轻工化工学院，广东广州 510006）（2.广东省植物资源生物炼制重点实验室，广东广州 510006）

精油是植物次级代谢产物，其含有的主要是挥发程度不同的各种液体有机物[1]，包括醛类（如柠檬醛）、酚类（如丁子酚、香芹酚）和醇类（如香叶醇）等[2]。精油一直以来被认为是绿色安全的，精油中的一些成分也已经得到安全性评估，并被认为是安全的，如α-蒎烯、芳樟醇及桉树醇等精油组分被Api 等[3-5]进行食品与化学毒理学评估并获得认可。

肉桂精油是一种黄色至红褐色的澄清液体，主要存在于肉桂的桂枝、桂皮、果实等部位，其有效成分主要有肉桂醛、蒎烯、邻甲氧基肉桂醛和杜松烯等。肉桂精油还具有良好的抑菌[6]能力，对细菌[7]及真菌[8]均具有良好的抑制或杀灭作用。肉桂精油抗菌能力可应用于诸多领域，如Chang 等[9]发现，土肉桂具有良好的抗嗜肺乳杆菌活性，可应用到度假或家庭水浴设施中的抗菌。Rangsuwan 等[10]发现肉桂精油可以抑制黄曲霉分生孢子及菌落的生长，在防治玉米发霉方面具有不错前景；Purkait 等[11]研究发现肉桂和丁香的组合在食品和制药行业中作为抗菌、抗氧化剂具有可靠性和安全性。近年来，肉桂精油抗菌机理不断被报道，如Bouhdid 等[12]在肉桂精油诱导铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的实验中发现，肉桂精油先是显著降低细菌细胞的代谢活性和复制能力，而后才对细菌膜完整性产生影响；Felso 等[13]研究发现，肉桂精油能够改变铜绿假单胞细菌外膜蛋白，低浓度时，增加了铜绿假单胞细菌的外膜蛋白量，高浓度时，其处理过的菌外膜分子量为42.7 和80.8 ku 的蛋白质消失，说明肉桂精油可以通过改变细菌生物膜的外膜蛋白成分，进而达到抑制细菌生长的能力。

目前报道的精油抑菌方式主要有直接接触法和气相熏蒸法，有研究表明，气相熏蒸方式下精油的抗菌活性可能更可靠，如Goni 等[14]认为，直接接触方式下，起抗菌作用的主要是亲水性更强和挥发性较小的物质，而气相实验中，顶空释放的挥发性化合物（亲水性和疏水性）和一部分在琼脂表面吸收的亲水性化合物之间达到了平衡，因此气相实验用来估计精油的抗菌活性可能更为可靠。本研究在气相熏蒸的基础上，通过改变肉桂精油气相香氛方式，采用自然挥发、水浴加热、燃烧、喷雾雾化四种香氛方式，讨论其对白色葡萄球菌抑制、杀灭作用的影响，并进一步利用电子鼻、HS-SPME-GC-MS，分析四种香氛方式具有相同杀菌能力时，其香氛气体成分构成的变化。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

白色葡萄球菌（Staphylococcus8032），广东省微生物研究所；真空干燥器（空间体积6.5 L），广州广淘科技股份有限公司；培养皿（环球60 mm），广州市天力达化玻有限公司；营养琼脂，广州环凯微生物科技有限公司；封口膜（14×14 cm，膜直径30 mm），常德比曼客生物科技有限公司；肉桂精油（99%），香飘三创众创平台提供；CAR/PDMS 萃取头（75 μm），美国SUPELCO 公司；实验用水为去离子水。

1.2 实验仪器

YX280/20 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-2F 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SPX-25 生化培养箱，上海锐丰仪器仪表有限公司；（GC7890B-MS 5977B，Agilent）气相色谱-质谱联用仪，日本岛津；PEN3 电子鼻，德国AIRSENSE 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 香氛形成方式对肉桂精油抗菌活性实验

四种香氛方式中，水浴加热与自然挥发是将肉桂精油与丙二醇混合稀释，燃烧与喷雾雾化方式是将肉桂精油与乙醇混合稀释。本实验装置使用玻璃真空干燥器，在其内放置小铁架，用于倒置涂有菌液的小培养皿，底部可放置精油溶液或丙二醇，装置顶部包裹透气不透菌封口膜，具体装置如图1。

图1 气相熏蒸装置Fig.1 Vapor phase fumigation device

1.3.1.1 自然挥发香氛方式

（1）将需要用到的培养皿、培养基、涂布棒等材料包装好后在121 ℃下，高温高压灭菌处理20 min，烘干备用。

（2）菌种活化：取实验室斜面菌种划线活化并进行传代培养，传至2～3 代备用。

（3）涂布：将传代好的白色葡萄球菌稀释至106～107CFU/mL，吸取50 μL 菌液在倒好的培养基上，用涂布棒涂抹均匀[15]。

（4）将精油按空间浓度0、10、20、30、40、50 μL/L依次添加到准备好的装置中，并迅速放入涂布好菌液的培养基，盖上盖子，并用封口膜将缝隙封好，装置上端圆孔使用透气不透菌封口膜封紧。

（5）将上述装置摆放在相同的实验环境下，记录每日温度、湿度，培养1～2 d，直至有培养皿表面生长出均匀的菌落。

（6）将装置中的菌板在无菌操作台内取出，观察菌落生长情况并做记录；每个培养皿挖取3 个大小相同的6 mm 圆孔转移到新的干净培养基，并放入培养箱在37 ℃下培养24 h。

（7）观察圆孔周围菌落生长情况并做记录。

步骤（4）、（6）均做三个平行。

1.3.1.2 燃烧香氛方式

将空间浓度为0、10、30、50、100、200 μL/L 的精油依次添加到准备好的装置中，并迅速放入3 个涂布好菌液的培养基，盖上盖子，并用封口膜将缝隙封好，从装置上端伸入打火器点燃酒精-肉桂溶液，点燃后将装置上端圆孔使用透气不透菌封口膜封紧。其余步骤与自然挥发相同。

1.3.1.3 水浴加热香氛方式

将空间浓度为0、10、30、50、100、200 μL/L 的精油依次添加到准备好的装置中，并迅速放入3 个涂布好菌液的培养基，盖上盖子，并用封口膜将缝隙封好，装置上端圆孔使用透气不透菌封口膜封紧。将装置底部依次放入温水盆内，并保持水温在40 ℃～50 ℃间，放置时间为1.5 h～2 h。其余步骤与自然挥发相同。

1.3.1.4 喷雾雾化香氛方式

将空间浓度为0、5、10、15、200 μL/L 的精油依次添加到准备好的喷雾器中，并迅速放入3 个涂布好菌液的培养基，随后打开雾化器开关，迅速放入装置内，盖上盖子，并用封口膜将缝隙封好，装置上端圆孔使用透气不透菌封口膜封紧。其余步骤与自然挥发相同。

1.3.2 不同香氛形成方式下肉桂精油的成分分析

1.3.2.1 电子鼻

使用电子鼻采集四种香氛方式的气体成分：25 ℃下，取四种香氛方式在1.3.1 抗菌实验中，得到的最低杀菌浓度的肉桂精油溶液置于实验装置内（干燥器）顶空40 min；电子鼻洗气80 s；数据采集100 s；气体流量为600 mL/min。

1.3.2.2 SPME-GC-MS

四种香氛方式（水浴、自然挥发、雾化、明火燃烧）均使用1.3.1 得到的最低杀菌浓度，气体成分采集使用SUPELCO 固相微萃取SPME 方法。水浴方法为取样品于蒸发皿中，加入丙二醇稀释，置于干燥器中水浴40 ℃加热吸附萃取；自然挥发取样品于蒸发皿中，加入丙二醇稀释，直接置于干燥器中吸附萃取；雾化方法取样品于蒸发皿中，加入乙醇稀释，使用专用雾化器雾化完毕后吸附萃取；明火燃烧取样品于蒸发皿中，加入乙醇，置于干燥器中点火燃烧完毕后吸附萃取；吸附萃取将老化完成的75 μm CAR/PDMS 涂层萃取头插于干燥器中悬空吸附40 min，萃取完成后于进样口解吸5 min。

气相色谱参数：仪器型号：Agilent 7890B；色谱柱：HP-5MS UI（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样体积：0.2 μL（精油直接进样）；进样口温度：250 ℃；进样模式：直接进样分流比120：1；SPME 采集进样为不分流进样；载气模式：恒流1 mL/min；传输线温度：300℃；升温程序：50 ℃（3 min）_2 ℃/min_180 ℃（0 min）_20 ℃/min_300 ℃（10 min）。

质谱参数：仪器型号：Agilent 5977B GC/MS；离子化方式：EI，atune；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；扫描范围：29～550 u；溶剂延迟：5 min（雾化挥发方式）。

1.3.3 数据处理

抗菌活性实验、电子鼻分析数据利用Excel 处理，图形绘制用Origin 2021。HS-SPME-GC-MS 结果采用Agilent 5977B 对样品进行分析，结合Nist14 和百花香料公司自建香料谱库进行定性检索，并结合保留时间辅助定性。

2 结果与讨论

2.1 香氛形成方式对肉桂精油抗菌活性的影响

四种香氛形成方式均对白色葡萄球菌均具有良好的抑制、杀灭作用。四种香氛方式下的MIC、MBC如表1。四种精油香氛方式的抑菌效果为：喷雾雾化＞水浴加热＞自然挥发＞燃烧；杀菌效果为：水浴加热＞喷雾雾化＞自然挥发＞燃烧。

表1 四种香氛方式下的抗菌效果Table 1 Bacteriostatic and bactericidal effects under four volatilization modes

由表可知，水浴加热的MBC 值最小，为10 μL/L（0.01 μL/mL），可能是水浴加热方式下，精油挥发出了更多有效抗菌活性成分，表现出显著杀菌效果；喷雾雾化方式的MIC 值最小，为5 μL/L，可能是喷雾器可以强制性地雾化精油中不易挥的成分，增大空气中抗菌成分浓度，从而产生显著抑菌效果；燃烧方式下抗菌活性最差，MIC 为100 μL/L，MBC 为200 μL/L，可能是高温燃烧的方式，导致精油中具有抗菌活性的成分失活，从而降低了空间内精油的有效抗菌活性成分浓度，例如在高温下，可能加速萜烯类与空气中的氧发生氧化和聚合[16]反应，生成CO2、水，空间内有效成分浓度降低，抗菌活性相应也降低；自然挥发方式具有良好的抗菌活性，其最低抑菌浓度为30 μL/L，最低杀菌浓度为40 μL/L，此方式也是四种方式中最简单易操作的。与吴红影等[17]利用肉桂精油气相熏蒸得到的MIC 值0.006 25 μL/mL 相比，喷雾雾化的MIC 值5 μL/L（0.005 μL/mL）更具有优势。与段雪娟等[18]利用肉桂精油气相熏蒸的MIC 值0.25 μL/mL，MBC 值0.50 μL/mL 相比，喷雾雾化和水浴加热两种香氛方式的MIC、MBC 值都更小。从抗菌实验结果来看，水浴加热和喷雾雾化两种香氛方式都极大地提高了肉桂精油抑制、杀灭细菌的能力。

2.2 香氛形成方式对肉桂精油气体成分影响

2.2.1 电子鼻分析

四种香氛方式电子鼻指纹图谱如图2 所示，传感器各序列号所对应代表化合物种类[19]如表2。结合表2与图2a 可知，燃烧方式对S7、S9 传感器响应值均比较低，S7 响应与精油中萜烯类有关，S9 响应与精油内芳香成分有关，可能是燃烧的香氛方式温度过高，萜烯和芳香成分随溶剂在高温下迅速发生挥发、燃烧和反应，生成CO2和H2O，降低了空间内这两类物质的含量；喷雾雾化方式对所有有响应的传感器都响应值高，与前面抑菌实验中分析相符：在强制性雾化方式下，不易挥发成分通过雾化方式飘散在空气中，极大地提高了空间中精油成分浓度；与自然挥发相比，水浴加热对S2、S6、S8、S9 传感器都更灵敏，可能是水浴加热的方式，使精油的温度升高，一些具有挥发性的成分及小分子物质能更容易的随溶剂挥发到气相中，增大了空间内成分浓度。

表2 不同传感器序列号所代表的化合物种类Table 2 Compounds represented by different sensor sequences

图2 四种香氛方式电子鼻传感器响应值指纹图谱Fig.2 Fingerprint of the response value of the electronic nose sensor in four fragrance modes

由图2b 雷达图可知，喷雾雾化和燃烧在雷达图中各序列号响应值存在较明显差异，能够被电子鼻很好的区分开。自然挥发与水浴加热方式在雷达图中重合性较好，电子鼻较难对这两种香氛方式加以区分。电子鼻对四种香氛方式气体成分分析实验中，只能对四种香氛方式的气体成分进行一个大类别的区分，其具体成分还需要进一步采用HS-SPME-GC-MS 的方式才能得到。

2.2.2 SPME-GC-MS 成分分析

四种香氛方式下气相成分HS-SPME-GC-MS 部分分析结果如表3，由表可知，四种香氛方式检测出的相对含量大于1%的化合物种类数具有显著差异，其中水浴加热（15 种）＞自然挥发（6 种）＞燃烧（4 种）和喷雾雾化（4 种）。四种香氛方式均使用MBC 的情况下，水浴加热明显挥发出更多种类相对含量大于1%的化合物。其中就包含多种萜烯，如α-蒎烯、β-石竹烯和香柠檬烯等，绝大多数的萜烯具有抗菌活性[20,21]。如Jin[22]等利用挥发性有机化合物对A549 和HepG2 细胞的细胞活力、氧化应激影响等研究，发现α-蒎烯可以通过调节氧化应激相关的信号通路来诱导细胞死亡；Gwak[23]等对热萃取柳杉时检测到的包括δ-杜松烯在内的32 种挥发性萜烯类进行抗菌活性研究，发现这些萜烯对红毛癣菌、毛癣菌和石膏微孢子虫具有抗菌活性。表3 列出的各香氛方式挥出相对含量在1%以上的组分存在差异，可能正是这些组分差异导致了各香氛方式下肉桂精油不同的抗菌活性。

表3 肉桂精油四种香氛方式相对含量1%以上的有机化合物Table 3 Organic components with a relative content greater than 1% detected by four fragrance mode of cinnamon essential oil

四种香氛方式采用HS-SPME-GC-MS 测得的主要有机化合物结果如表4。由表可知，在MBC 下，燃烧和喷雾雾化香氛方式下肉桂醛相对含量都较大，两种香氛方式下肉桂醛和α-蒎烯相对含量差异小，说明这两种方式起杀菌作用的成分可能一致，主要是靠高空间浓度的肉桂醛达到杀菌效果。喷雾雾化的杀菌能力仅次于水浴加热香氛方式，为20 μL/L 的空间浓度，该方式能将肉桂精油组分以喷雾的形式挥出，覆盖到整个装置内，增大了精油组分的空间浓度，从而表现出较好的杀菌效果。四种方式均取MBC，燃烧方式添加的肉桂精油空间浓度是水浴方式下的20 倍，喷雾方式下的10 倍，为200 μL/L，但该方式检测到的有机挥发性化合物并不多，其检测到的肉桂醛相对含量还稍低于喷雾雾化香氛方式。这是由于燃烧方式产生明火，高温燃烧了部分肉桂精油组分，其抑菌能力也就是四种方式中最差的。

表4 肉桂精油四种香氛方式主要有机化合物结果Table 4 The results of four perfuming methods of cinnamon essential oil

自然挥发和水浴加热香氛方式下，肉桂醛含量不及前两种方式，说明除了肉桂醛起作用外，可能还有其他挥发性有机化合物起作用，自然香氛方式下测得的相对含量大于1%挥发性有机化合物为6 种，α-蒎烯相对含量为前两种方式的将近两倍，β-石竹烯、γ-依兰油烯、δ-杜松烯3 种萜烯相对含量也在1%以上，故推测自然香氛方式下萜烯（如α-蒎烯）增强了肉桂醛杀菌能力；水浴加热香氛方式下的肉桂醛相对含量最低，这是由于水浴加热方式下的MBC 最小的，为10 μL/L的空间浓度，在该测试中添加的肉桂精油量最少，其杀菌效果表现出众，是因为加热情况下，更多的萜烯成分受热挥出，与肉桂醛协同，起到杀菌效果。如α-蒎烯、δ-杜松烯、β-红没药烯和γ-依兰油烯相对含量都在2%以上，α-依兰油烯等10 种萜烯测得相对含量均在1%以上，相对含量在1%以上的各萜烯相对含量和达到了29.76%。此时，其在肉桂精油水浴加热杀菌过程中，起到重要作用。故水浴加热杀菌能力强依赖于相对含量高的萜烯及肉桂醛共同作用。

上述成分分析结果与前面2.1 抑菌实验结果中“水浴加热、喷雾雾化具有很好的抗菌效果”结论相符合。

3 结论

四种香氛方式对白色葡萄球菌的抗菌实验中，发现不同香氛方式抑菌效果存在明显差异，且存在一定的规律性。其中，四种香氛方式抑菌能力强弱大小：喷雾雾化＞水浴加热＞自然挥发＞燃烧；四种香氛方式杀菌能力强弱大小：水浴加热＞喷雾雾化＞自然挥发＞燃烧。

四种香氛方式HS-SPME-GC-MS 数据采集实验中，均使用的是最低抑菌浓度，水浴加热挥发的有萜烯类成分相对含量较其他方式种类更多、更高，相对含量达29.76%，其中包括α-蒎烯、β-石竹烯和香柠檬烯等具有抗菌活性的萜烯化合物；喷雾方式雾化出相对含量达74.26%的肉桂醛，这两种方式均能够在很低的肉桂精油浓度下，具有很好的抗菌能力，虽然达到效果的方式存在差异，但却能给人们在使用精油进行抑菌、杀菌时，提供更多的选择。自然挥发的方式抑菌、杀菌效果也表现良好，这可能与其挥发出成分种类有一定关系，与水浴方式相比，其检测出的成分种类很相似，但各成分相对含量稍低。综合来看，水浴加热和喷雾雾化两种香氛方式的抗菌能力是最佳的。