胜红蓟内生真菌转化柠檬烯产物的抑菌活性

裴真巧，王奇志，杨道茂，于海玲

(华侨大学 化工学院，福建 厦门 361021)

胜红蓟(AgeratumconyzoidesL.)是菊科胜红蓟属一年生草本，具有清热解毒、消炎止血、抗菌及抗胃溃疡等药效[1-4].研究表明，胜红蓟内生微生物易产生与宿主相同或相似的生物活性物质[5].胜红蓟内生微生物的发酵液及菌体对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphlococcusaureus)和大肠杆菌(EscherichiacoliATCC 25922)具有较好的抑菌活性[6-8].前期研究发现，从胜红蓟中分离出来的内生真菌发酵液的粗提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)表现出良好的抑菌活性[9].

目前，利用微生物进行生物转化的研究逐渐引起人们的广泛关注，该方法不仅对环境的影响小，还可以将廉价的底物转变成高附加值的产物.柠檬烯(limonene)又名苎烯，属单萜类化合物，是年产量大、价格低廉的农业和工业副产品，将其作为转化前体用于生物转化，获得的转化产物具有较高的经济价值[10].研究学者发现真菌ColletotrichumnymphaeaeCBMAI 0864转化柠檬烯的产物对病原真菌Cryptococcusneoformans具有较强的抑制作用[11-13].对生物转化柠檬烯的转化产物分析发现，紫苏醇、香芹酮、卡维醇、二氢香芹酮和α-松油醇等生物活性丰富的产物[14-15]具有深入研究的价值.

本文从22 株胜红蓟内生真菌中筛选具有转化柠檬烯能力的菌株，并考察其生物转化柠檬烯发酵液乙酸乙酯粗提物对指状青霉(Penicilliumdigitatum)、柑橘炭疽病菌(Gloeosporiumfrucrigenum)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)和油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)的抑菌活性.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株 从外来入侵植物胜红蓟中分离出22 株内生真菌[9]，包括从根中分离的5 株内生真菌Fusariumsolani(wp02)，Schizophyllumcommune(wp05)，Lasiodiplodiatheobromae(wp04)，Rhizomucorvariabilis(wp03)，Alternariaalternata(wp06)；从花中分离的7 株内生真菌Phyllostictacapitalensis(wf06)，Fusariumstriatum(wf03)，Fusariumoxysporum(wf04)，Curvulariachiangmaiensis(wf01)，Diaporthephaseolorum(wf07)，Diaporthelongicolla(wf02)，Fusariumstriatum(wf05)，从茎中分离的5 株内生真菌Letendraeasp.(wz06)，Fusariumlateritium(wz01)，Paraconiothyriumcyclothyrioides(wz05)，Bartaliniapondoensis(wz03)，Paraconiothyriumcyclothyrioides(wz02)，从叶中分离的5 株内生真菌Colletotrichumcobbittiense(wl05)，Botryosphaeriadothidea(wl03)，Diaporthephaseolorum(wl01)，Cercosporakikuchii(wl02)，Phyllostictacapitalensis(wl04).

指状青霉(Penicilliumdigitatum)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)和柑橘炭疽病菌(Gloeosporiumfrucrigenum)由华中农业大学龙超安教授提供；油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)由华侨大学杨道茂博士提供；香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)由华侨大学王明元副教授提供.

1.1.2 试剂 马铃薯葡萄糖(PDB)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、青霉素钾、硫酸链霉素、胰蛋白胨、葡萄糖水(深圳市晨泓科技有限公司)；(+)- 柠檬烯、柠檬烯-1，2-二醇标准品(纯度>97%，美国Sigma有限公司)；无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚(上海国药集团化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯.

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖液体双抗培养基配方为PDB 40.1 g，蒸馏水1 000 mL，青霉素钾150 mg，硫酸链霉素120 mg.青霉素钾和硫酸链霉素用于抑制芽孢杆菌等细菌的生长，对内生真菌的生物活性没有抑制作用，二者均不能高压保温灭菌，需待培养基冷却至60 ℃过滤灭菌再加入.

试验所用物品的灭菌条件均为0.1 TPa，120 ℃灭菌20 min.

1.2 仪器与设备

GF254硅胶板(50 mm×100 mm，山东省青岛海洋化工有限公司)；超净工作台(浙江苏净净化设备有限公司)；GC-MS-QP2010 Ultra型气质联用仪(日本Shimadzu公司)；pH计(深圳衡欣科技股份有限公司)；灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；布氏漏斗、旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司).

1.3 试验方法

1.3.1 菌株培养及转化产物制备 将22 株内生真菌分别接种至马铃薯葡萄糖液体双抗培养基中，置28 ℃恒温培养48 h活化；取直径为5 mm的菌块接入装有100 mL液体培养液的锥形瓶中，在28 ℃，200 r·min-1的摇床中培养72 h后，加入体积分数为0.5%的柠檬烯和无水乙醇的混合溶液；继续转化培养96 h后，将各菌株的发酵液用布氏漏斗抽滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸干并用甲醇复溶.经无水硫酸钠脱水后，将浓缩液置于10 mL的试管中，封闭保存于黑暗条件下，备用.对样品进行薄层色谱(TLC)分析，以柠檬烯-1，2-二醇标准品为对照，验证内生菌株转化柠檬烯是否生成柠檬烯-1，2-二醇.

TLC检测条件：在硅胶板上，用毛细管(0.5 mm×10 mm)分别吸取上述制备的样品及底物对照组发酵液进行点样，并将其置于体积比为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=15∶4的展开剂中展开；显色剂为香草醛-硫酸-乙醇溶液(15 g香草醛溶于250 mL体积分数为1%的浓硫酸-乙醇溶液中).

转化产物质量浓度的测定：根据预实验结果，转化的主要产物是柠檬烯-1，2-二醇，参考杜钢等[16]的检测方法，称取柠檬烯-1，2-二醇标准品，用无水乙醇配制成不同质量浓度(0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0 mg·mL-1)的溶液，根据标准品的质量浓度和气相色谱质谱测得的相应质量浓度的峰面积，使用Origin 9.0进行回归方程的拟合，最终得到回归方程Y=607 443.39x-228 129.17(R2=0.996 7).将获得的主产物的峰面积代入回归方程中，可得内生真菌转化产物的质量浓度.

1.3.2 产物成分分析 气相色谱-质谱(GC-MS)参考杨道茂等[17]的检测方法，设置检测条件如下：色谱柱为Rxi-5sil MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱箱温度为70 ℃，进样口温度为250 ℃，柱流量1 mL·min-1，分流比1∶2，进样量1 μL，升温程序为柱温60 ℃×3 min→升温速度10 ℃·min-1→柱温150 ℃×5 min→升温速度20 ℃· min-1→柱温250 ℃×3 min.质荷比(m/z)扫描范围为40～200.将上述制备的样品及对照组发酵萃取液用移液枪取1.5 mL置于色谱瓶中，用于产物成分分析.

1.3.3 菌株转化柠檬烯乙酸乙酯粗提物抑菌活性测定 利用菌丝生长速率法，测定样品对植物病原菌的抑制作用[18].取体积分数为0.5%(100 μL)的样品加入体积为20 mL的PDA琼脂平板中，待凝固后，取直径为5 mm的病原菌菌块接种至平板中央，将添加等量乙酸乙酯、空白平板作为对照组.将接种后的平板置于28 ℃的恒温培养箱中培养，待对照组长满平板时，计算抑菌率，其计算公式为

(1)

1.4 数据处理

试验结果均以 3 次重复试验的平均值±标准偏差表示.采用Origin 9.0软件进行数据统计学意义分析并绘图.

2 试验结果与分析

2.1 柠檬烯生物转化菌株的筛选

图1 胜红蓟内生真菌生物转化柠檬烯薄层色谱图Fig.1 TLC of limonene biotransformation by endophytic fungi from Ageratum conyzoides

将22个内生真菌转化柠檬烯发酵液乙酸乙酯粗提物在硅胶板上形成的点与转化产物柠檬烯-1，2-二醇形成的点进行比对.胜红蓟内生真菌生物转化柠檬烯薄层色谱图，如图1所示.图1中：编号1～23分别为wp02，wp05，wp04，wp03，wp06，wf06，wf03，wf04，柠檬烯-1，2-二醇，wf01，wf07，wf02，wf05，wz06，wz01，wz05，wz03，wz02，wl05，wl03，wl01，wl02，wl04.结果发现，加入底物柠檬烯培养4 d后，菌株wp02，wp03，wf03，wf01，wf05，wz01，wl05，wl02，wf07，wp06，wl01，wz03，wf06，wf04具有转化柠檬烯的能力，其中，菌株wp03，wp06，wf07，wf05，wz03和wl01(红色圆圈表示的菌株)与转化产物柠檬烯-1，2-二醇形成的点的比移植(Rf)相同，因此，推测上述6个菌株具有生物转化(+)-柠檬烯生成柠檬烯-1，2-二醇的能力.将菌株wp02，wf06，wf03，wf04，wz01，wl05与转化产物柠檬烯-1，2-二醇对照组形成的斑点进行比对，发现它们的斑点较浅，证明这几个菌株生物转化(+)-柠檬烯的能力较弱，因此，在后续的试验中并未将其作为研究对象.

2.2 菌株转化柠檬烯产物分析

不同菌株的气相色谱-质谱总离子流图，如图2所示.图2中：t为保留时间；δ为绝对丰度.

(a) 菌株wf05 (b) 菌株wf07

(c) 菌株wl01 (d) 菌株wp03

(e) 菌株wp06 (f) 菌株wz03

(g) 标准品底物柠檬烯 (h) 标准品转化产物柠檬烯图2 不同菌株的气相色谱-质谱总离子流图Fig.2 Total ion flow diagrams of gas chromatography-mass spectrometry of different strains

图3 不同菌株转化产物的质量浓度Fig.3 Mass concentration of transformation products of different strains

将菌株wp03，wp06，wf07，wf05，wz03，wl01的生物转化的乙酸乙酯粗提物与底物柠檬烯和产物柠檬烯-1，2-二醇标准品的GC-MS图进行对比分析发现，菌株具有转化柠檬烯的能力，该结果与薄层色谱的结果(图1)一致，并且生成了柠檬烯-1，2-二醇.其中，菌株wf07，wp06，wl01，wz03形成的转化产物(柠檬烯-1，2-二醇)峰信号不仅比菌株wp03和wf05强，而且对应的底物(柠檬烯)的峰信号也低，证明它们转化柠檬烯生成新物质的能力较强.

不同菌株转化产物的质量浓度，如图3所示.图3中：ρ为柠檬烯-1，2-二醇的质量浓度；相同字母表示数据之间的差异不具有统计学意义，不同字母(a，b，c)之间表示差异具有统计学意义，P<0.05.由图3可知：菌株wl01，wp06，wz03转化柠檬烯生成柠檬烯-1，2-二醇质量浓度的差异不具有统计学意义，其生物转化(+)-柠檬烯生成柠檬烯-1，2-二醇的能力强于菌株wf05，wf07，wp03，且菌株wl01转化柠檬烯生成的柠檬烯-1，2-二醇的质量浓度最高，为3.43 mg·mL-1；菌株wf05和wf07转化柠檬烯生成柠檬烯-1，2-二醇质量浓度的差异也不具有统计学意义.

2.3 菌株转化柠檬烯的乙酸乙酯粗提物的抑菌活性

胜红蓟内生真菌转化柠檬烯乙酸乙酯粗提物对柑橘炭疽病菌、意大利青霉和指状青霉等致病菌具有一定的抑菌活性.不同菌株转化发酵液对5 种植物病原真菌的抑菌活性，如表1所示.表1中：“-”表示无抑菌活性.由表1可知：菌株wp06转化柠檬烯的乙酸乙酯粗提物对意大利青霉的抑菌率最高，其值为(40.03±3.58)%(P<0.05)；菌株wz03转化柠檬烯的乙酸乙酯粗提物对柑橘炭疽病菌的抑制率达到(28.69±1.03)%(P<0.05)；菌株wf05对指状青霉的抑菌率为(27.17±1.75)%；而菌株wz03对香蕉枯萎病菌抑菌率仅有(2.36±0.68)%；内生真菌转化柠檬烯的乙酸乙酯粗提物对油茶炭疽病菌无抑菌活性.

表1 不同菌株转化发酵液对5 种植物病原真菌的抑菌活性Tab.1 Antifungal activity of fermentation broth transformed by different strains against five plant pathogenic fungi

3 结论

从22 个胜红蓟内生真菌中共筛选得到14 个具有转化柠檬烯能力的菌株，其中，菌株Fusariumstriatum(wf05)，Diaporthephaseolorum(wf07)，Diaporthephaseolorum(wl01)，Rhizomucorvariabilis(wp03)，Alternariaalternata(wp06)，Bartaliniapondoensis(wz03)转化柠檬烯产物是柠檬烯-1，2-二醇.菌株wf05，wf07和wl01同属的真菌也能转化生成柠檬烯-1，2-二醇[19-21]，菌株ColletotrichumnymphaeaeCBMAI 0864[11，22]，Phomopsissp.[23]，Aspergilluscellulosae[24]通过生物转化柠檬烯也可以生成柠檬烯1，2-二醇.间座壳属的wl01和wf07、链格孢属的wp06、顶多毛孢属的wz03菌株转化柠檬烯的能力较强.GC-MS检测结果表明，菌株wf05，wf07，wl01，wp03，wp06，wz03转化柠檬烯的主要产物是柠檬烯-1，2-二醇，其中，菌株wl01转化柠檬烯的能力最强，转化产物柠檬烯-1，2-二醇的质量浓度为3.43 mg·mL-1，高于其同属(间座壳属)转化产物柠檬烯-1，2-二醇的质量浓度(3.02 mg·mL-1)[14].Sales等[11]对生物转化柠檬烯工艺进行优化后发现，转化产物柠檬烯-1，2-二醇的最高质量浓度为4.19 g·L-1.因此，可以对菌株wl01转化柠檬烯的工艺进行优化，从而提高其转化生成柠檬烯-1，2-二醇的能力.

研究结果表明：萜类化合物具有抗菌和消炎等生物活性[25-26]，而柠檬烯-1，2-二醇作为其衍生物，对新生隐球菌(Crytococcusneoformans)具有较好的抑制作用[21，27].此外，抑菌活性测定结果表明，菌株wp06转化柠檬烯的发酵液乙酸乙酯粗提物对意大利青霉的抑菌作用显著((40.03±3.58)%)，菌株wz03对柑橘炭疽病菌的抑菌率较好((28.69±1.03)%)，菌株wf05对指状青霉具有一定抑菌效果((27.17±1.75)%)；仅有菌株wz03对香蕉枯萎病菌有微弱的抑菌作用((2.36±0.68)%)；菌株转化柠檬烯发酵液的乙酸乙酯粗提物对油茶炭疽病菌没有抑菌作用.

综上所述，从胜红蓟中分离出的内生真菌具有转化柠檬烯的能力，且转化产物对意大利青霉类柑橘致病菌具有较好的抑菌活性.然而，具体发挥抑菌作用的是粗提物还是单体物质有待进一步深入研究.