HPLC-DAD 法同时测定银翘解毒丸中7 种成分的含量*

2023-01-18 14:05易徐航张钰祺
中国中医药现代远程教育 2023年4期
关键词:草苷牛蒡木犀

李 霞 易徐航 张钰祺

(萍乡市食品药品检验所,江西 萍乡 337000)

银翘解毒丸由清代医学家吴鞠通所著《温病条辨》中的银翘散演变而来,作为风热感冒的一种常用首选复方制剂,具有辛凉解表、清热解毒的功效。君药金银花-连翘作为清热解毒经典药对,具有抗病毒、抗菌、抗内毒素及免疫调节等作用,特别是抗病毒作用效果更佳[1]。金银花主要有效成分绿原酸据报道,其具有抗菌抗炎等药理作用[2],木犀草苷具有降血脂、抗病毒等作用,同时木犀草苷是区别金银花与山银花、忍冬藤的主要特征成分,具有较强的呼吸道杀菌作用。连翘的主要活性成分连翘苷和连翘酯苷A,二者含量已被《中华人民共和国药典》2020 年版一部收载作为重要检测指标来评价药材质量优劣。臣药牛蒡子清热利咽喉,同时疏散风热,活性成分牛蒡苷具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌等多种生物活性[3]。使药甘草调和诸药,并与桔梗合用增强解毒利咽散结之功效,常以甘草苷及甘草酸作为指标成分来测定含量。

银翘解毒丸现行的质量标准为WS3-B-3693-98(蜜丸)、WS3-3693-98-1(小蜜丸和水蜜丸)、WS3-B-2782-97(浓缩丸)以及《中华人民共和国药典》(浓缩蜜丸)2020年版一部[4]。标准中主要通过显微鉴别,薄层色谱定性检测其中多味药材,浓缩蜜丸质量标准中收载了金银花中绿原酸的含量检测项目,但检测成分单一,不能从整体把控制剂的质量。对其质量控制研究的报道,主要集中在以HPLC 单波长检测金银花、连翘、牛蒡子、甘草中一两味药材指标成分的检测[5-8]。中药成分复杂多样,建立多指标成分进行含量测定显得尤其重要。本研究采用HPLC-DAD 法同时测定银翘解毒丸中7种活性成分含量,主要目的是有效控制制剂质量以及临床用药疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(型号:1200 型)-二极管阵列检测器(安捷伦),CPA225D 十万分之一电子分析天平(赛多利斯),ME-204 万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多),KQ-100DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),纯水仪(普力菲尔)。

1.2 试药 乙腈(赛默飞世尔科技)、磷酸(科密欧化学试剂有限公司)均为色谱级,甲醇(湖南汇虹试剂有限公司,批号为2011125.3),水为UP 级。绿原酸(批号为PF200705-11,纯度为99.48%),连翘酯苷A(批号为PF200719-02,纯度为99.89%),甘草苷(批号为PF200318-04,纯度为98.84%),木犀草苷(批号PF200517-08,纯度为98.20%),连翘苷(批号为PR200603-11,纯度为98.47%),牛蒡苷(批号为PF200907-02,纯度为98.15%),甘草酸铵(批号为RJ200104-16,纯度为98.63%),以上7 种对照品均由Sanford Chemicals 提供。

阴性药材均购自市场,均经萍乡市食品药品检验所药品室易徐航鉴定为正品。银翘解毒丸为市售产品,18 批样品信息见表1。

表1 18 批银翘解毒丸样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用色谱柱Agilent 5TC-C18(2)250 mm×4.6 mm;流动相A(乙腈):B(0.3%磷酸),梯度洗脱(0~10 min,10%→20%A;10~20 min,20%→20%A;20~30 min,20%→30%A;30~60 min,30%→100%A;60~65 min,100%→10%A);柱温:30 ℃;检测波长:230 nm,340 nm;进样体积:10 μL;流速:1 mL·min-1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取绿原酸对照品11.64 mg、连翘酯苷A 对照品11.17 mg、甘草苷对照品9.38 mg、木犀草苷对照品8.83 mg、连翘苷对照品13.01 mg、牛蒡苷对照品12.45 mg、甘草酸铵对照品10.54 mg 分别置于10 mL 量瓶中,制成对照品贮备液,用50%甲醇溶液溶解稀释制成绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)的质量浓度分别为0.0232、0.0223、0.0185、0.0173、0.0256、0.0244、0.1018 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 样品溶液 取水蜜丸研碎(蜜丸剪碎),精密称定约1.2 g,精密加入50%甲醇50 mL 溶解并稀释,加热回流30 min,静置放冷后用50%甲醇补足重量,混合均匀后过滤取续滤液即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按工艺方法制备缺金银花、连翘、牛蒡子、甘草阴性样品,按样品溶液制备方法制备成缺金银花、连翘、牛蒡子、甘草的阴性样品溶液。见图1。

图1 银翘解毒丸中7 种成分HPLC 色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取各对照品贮备液制成质量浓度绿原酸为11.6 μg·mL-1、连翘酯苷A 为11.2 μg·mL-1、甘草苷为1.9 μg·mL-1、木犀草苷为1.7 μg·mL-1、连翘苷为5.1 μg·mL-1、牛蒡苷为12.2 μg·mL-1及甘草酸铵为10.4 μg·mL-1的混合溶液。分别精密量取1、2、4、8、12、16、20 μL 注入液相色谱仪,测定混合对照品的峰面积,以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,制作标准曲线并计算得线性回归方程。见表2。

2.3.2 检测限与定量限 用对照品贮备液进行逐级稀释测定检测限与定量限,以3 倍信噪比测得检测限,以10 倍信噪比测得定量限,各成分检测限与定量限。见表2。

表2 银翘解毒丸中7 种成分线性曲线、检测限和定量限

2.3.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL,注入色谱仪,连续进样5 次,结果绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸铵峰面积的相对标准差(Relative standard deviation,RSD)%分别为0.19%、0.19%、0.19%、0.16%、0.17%、0.46%、0.12%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取S2 供试品溶液分别于0、2、8、12、24 h 时进样10 μL,注入色谱仪,测定峰面积,结果样品在24 h 内稳定性良好,绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸铵峰面积的RSD%分别为0.40%、1.22%、0.33%、1.69%、0.58%、2.09%、2.45%。

2.3.5 重复性试验 取S2 样品6 份,按2.2.2 方法制备溶液,每份连续测定3 次,测定绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸的平均含量分别为0.5363 mg·g-1、3.7127 mg·g-1、0.1431 mg·g-1、0.1114 mg·g-1、1.4897 mg·g-1、0.3873 mg·g-1、0.6124 mg·g-1,RSD%分别为1.48%、0.87%、2.05%、2.26%、1.40%、1.80%、2.95%,结果表明本法重现性良好。

2.3.6 加样回收试验 取已测得含量的S2 样品6 份,每份精密称取约0.5 g,精密加入绿原酸0.2316 mg、连翘酯苷1.1158 mg、甘草苷0.1854 mg、木犀草苷0.1734 mg、连翘苷0.6405 mg、牛蒡苷0.2444 mg以及甘草酸0.3047 mg,按2.2.2 方法制备溶液,取10 μL 注入色谱仪,进行测定,计算回收率。结果绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸平均回收率分别为:97.6%、100.8%、98.7%、99.2%、101.7%、101.8%、96.6%,RSD%分别为2.69%、2.08%、2.52%、1.81%、2.09%、2.31%、1.12%。

2.3.7 样品含量测定 选取不同生产企业18 批样品,按样品溶液制备方法2.2.2 制备,各平行制备2 份样品溶液,按上述色谱条件进行测定,采用外标法计算各成分的含量,结果见表3。

由表3 可知,18 批银翘解毒丸中7 种成分的含量存在明显差异。同一生产企业生产的不同批次样品,7种成分含量大体相当,不同剂型、不同厂家样品差异性较大,以绿原酸、连翘酯苷A、牛蒡苷的含量差异最为明显。

表3 银翘解毒丸中7 种成分的含量测定结果 (mg·g-1,n=2)

3 讨论

3.1 提取方法的选择 对供试品溶液采取不同的处理方法(超声和加热回流),提取时间(超声10、30、60 min 与加热回流10、30、60 min)等进行考察,结果提取相同时间,加热回流的处理方法对指标成分的提取效果更好。加热回流30 min 各指标成分能提取完全,故选取加热回流30 min 作为供试品溶液的提取方法。

3.2 检测波长的选择 经过二极管阵列检测检测器(Diode Array Detector,DAD)对对照品溶液在150~450 nm 内进行紫外光谱扫描,并采集光谱图。绿原酸在240 nm 和327 nm 处有最大吸收,连翘酯苷在280 nm 和327 nm 处有最大吸收,甘草苷、连翘苷、牛蒡苷在230 nm 和280 nm 处均有最大吸收,木犀草苷在250 nm 和350 nm 处有最大吸收,甘草酸铵在250 nm 处有最大吸收,为提高实验方法的准确性和灵敏度,最终考虑选择在230 nm 波长下检测甘草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸,在340 nm 波长下检测绿原酸、连翘酯苷A、木犀草苷。

3.3 流动相的选择 考察了甲醇-0.1%磷酸,乙腈-0.1%磷酸,甲醇-0.3%磷酸,乙腈-0.3%磷酸4 种不同的流动相进行梯度洗脱,结果显示乙腈-0.3%磷酸为流动相洗脱效果最好,各色谱峰峰型,分离效果以及基线平稳度最好。故最终以乙腈-0.3%磷酸作为流动相。

4 小结

综上所述,本研究采用HPLC-DAD 法同时对银翘解毒丸中7 种成分进行含量测定,该方法具有简单可行、灵敏度高、稳定性强等优点,可用于整体全面控制该制剂的质量,以保证产品质量稳定和临床用药疗效。

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