类风湿关节炎患者肠道菌群变化及其骨代谢的相关性研究

唐瑞霞　苏晗　邢倩

【摘 要】目的：分析类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者与健康人群肠道菌群的结构差异，探讨肠道菌群在RA骨代谢中的临床意义。方法：收集32例RA合并骨质疏松患者，30例RA合并骨量减少患者和32例健康对照者的粪便样本，利用Illumina MiSeq平台对样本16S rRNA基因序列V3-V4高变区进行PCR扩增及测序，分析Alpha、Beta多样性及菌群差异性，用LEfSe聚类分析法得到各组差异肠道菌群。观察各组对象RA相关抗体、炎性指标及血清骨代谢指标水平，对连续变量资料采用方差分析，同时与肠道菌群间进行Spearman相关性分析。结果：RA组肠道菌群厚壁菌门/拟杆菌门

（F/B）显著低于健康对照组（P < 0.05），而RA不同骨代谢水平组间F/B差异无统计学意义（P > 0.05）。采用Wilcox秩和检验进行组间差异显著性分析，提示3组间在菌群构成上差异有统计学意义（P = 0.001）。LEfSe分析寻找组间代表性菌属，结果表明，健康对照组的代表性菌属为p-Firmicutes、g-Megamonas、g-Agathobacter；RA合并骨質疏松组为o-Enterobacteriales、f-Enterobacteriaccae；RA合并骨量减少组为s-Bacteroides-plebeius，差异有统计学意义（LDA值均 > 4）。采用Spearman相关性检验与LEfSe分析相结合，结果显示，Megamonas菌属与类风湿因子（RF）、β胶联降解产物等骨代谢标志物（β-CTX）呈负相关

（P < 0.05）；Agathobacter菌属与RF、抗环瓜氨酸肽抗体呈负相关，与25-羟维生素D呈正相关（P < 0.05）；大肠埃希菌与PINP呈正相关（P < 0.05），与25-羟维生素D呈负相关（P < 0.05）。结论：RA患者存在肠道菌群失调，可能通过影响炎症因子、骨代谢标志物等方面参与RA骨代谢的异常。

【关键词】 类风湿关节炎；骨质疏松；肠道菌群；骨代谢；16S rRNA

Study on the Relationship Between Intestinal Flora and Bone Metabolism in Patients with Rheumatoid Arthritis

TANG Rui-xia，SU Han，XING Qian

【ABSTRACT】Objective：To analyze the structural differences of intestinal flora between patients with rheumatoid arthritis（RA）and healthy people，and to explore the clinical significance of intestinal flora in bone metabolism of RA.Methods：Fecal samples from 32 RA patients with osteoporosis，30 RA patients with osteopenia and 32 healthy controls were collected.The highly variable regions of the 16S rRNA gene sequence V3-V4 were amplified and sequenced using Illumina MiSeq platform.Alpha and Beta diversity analysis and flora difference analysis were performed.Differential intestinal flora in each group was obtained by LEfSe cluster analysis.The levels of RA related antibody，inflammatory index and serum bone metabolism index were observed in each group.Analysis of variance was used for continuous variable data，and Spearman correlation analysis was conducted for intestinal flora.Results：The intestinal microflora of Firmicutes/Bacteroides（F/B）in RA group was significantly lower than that in healthy control group（P < 0.05），while there was no significant difference in F/B between RA groups with different bone metabolism levels（P > 0.05）.Wilcox rank sum test was used to analyze the significance of differences between groups，indicating that there was a statistically significant difference in the composition of flora among the three groups（P = 0.001）.The results of LEfSe analysis showed that the representative genera of the healthy control group were p-Firmicutes，g-Megamonas，g-Agathobacteria;the RA group with osteoporosis was o-Enterobacterials and f-Enterobacteriacae;the RA group with reduced osteopenia was s-Bacteroides-plebeius，and the difference was statistically significant（LDA value > 4）.The results of using Spearman correlation test and LEfSe analysis showed that Megamonas was negatively correlated with RF and β-CTX）;Agathobacter was negatively correlated with RF and anti-cyclic citrullinated peptide antibody，and positively correlated with 25 hydroxyvitamin D;Escherichia coli was positively correlated with PINP and negatively correlated with

25 hydroxyvitamin D.Conclusion：RA patients have intestinal flora imbalance，which may be involved in abnormal bone metabolism in RA by influencing inflammatory factors and bone metabolism markers.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;osteoporosis;intestinal flora;bone metabolism;16S rRNA

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种侵犯滑膜和软骨的自身免疫性疾病，特征为多关节慢性炎症，伴有骨侵蚀和软骨破坏。RA患者易出现全身和局部骨质丢失，骨质疏松（osteoporosis，OP）发生率远高于正常人［1］。RA骨代谢异常可能与疾病本身及内外环境因素有关，其发病机制尚未阐明［2］。随着测序技术的不断发展，肠道菌群与宿主疾病的关系受到广泛关注。当发生菌群失调时，肠道菌群失去原有的保护功能，肠道黏膜屏障破坏，不能有效阻止病原菌进入机体，可激活免疫系统，导致多种疾病发生。目前许多研究证实，RA患者较正常人群肠道菌群结构存在明显差异［3］。国外一项大型前瞻性队列研究发现，慢性腹泻与RA的发病风险存在关联［4］。但肠道菌群失调是否参与RA的发生发展、是否对RA患者骨代谢存在影响尚不明确。本试验旨在研究RA患者不同骨代谢水平和健康对照人群肠道菌群的构成差异，同时进行相关性分析，初步揭示肠道菌群与RA骨代谢发病的关系。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2020年3月至2021年2月

在青岛市市立医院就诊的62例RA患者，分为RA合并OP组32例、RA骨量减少组30例，同时选取同期门诊健康人群32例为健康对照组。双能X线骨密度测定仪对患者进行腰椎前后位（L2～L4）、双侧股骨颈、大转子的骨密度（BMD）值测定。由经过专门培训的技术人员进行测量，BMD值低于同性别、同种族健康成人的骨峰值不足1个标准差属正常，降低1～

2.4个标准差为骨量减少，降低程度≥2.5个标准差诊断为OP。任一部位BMD的T值≤ -2.5即诊断为OP［5］。3组在性别、年龄、体质量指数（BMI）、吸烟等方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表1。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 诊断标准 按照2010年美国风湿病学会（ACR）和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）发布的RA诊断标准。

1.3 纳入标准 ①RA患者均符合上述诊断标准；②健康对照人群指未患有风湿病且骨量正常，以及无已知影响肠道菌群、骨代谢疾病的人群；③患者自愿参与，且签署知情同意书。

1.4 排除标准 ①BMI值明显偏离正常范围者；②重叠其他风湿病者，如系统性红斑狼疮、干燥综合征、严重膝骨关节炎等；③合并严重的肾、肝、心、脑和造血系统等严重疾病者；④合并精神疾病、胃肠炎及其他炎症性疾病和传染病者，妊娠期及哺乳期妇女；⑤8周内使用抗生素或益生菌治疗者；⑥有特殊饮食习惯者；⑦血钙及骨代谢指标明显偏离正常范围者；⑧使用大剂量激素治疗者；⑨资料不完整者。

2 方 法

2.1 治疗方法 RA患者组接受规范药物治疗，口服免疫抑制剂甲氨蝶呤片（上海上药信谊药厂有限公司，批号220901，规格2.5 mg），每次7.5～12.5 mg，每周1次，碳酸钙D3咀嚼片（惠氏制药有限公司，国药准字H10950030，规格碳酸钙0.75 mg、维生素D3 60国际单位），每次1片，每日1次。为保证健康对照组血钙水平（CA）不受口服补钙剂影响，选取预防性补钙（碳酸钙D3咀嚼片，每次1片，每日1次）老年人群为健康对照组。

2.2 肠道菌群测定 收集研究对象的清晨（6：00～8：00）新鲜大便标本2 mL于一次性无菌粪便采集管中，收集后置于液氮中，研究人员30 min内将标本转移至实验室，并将粪便标本转移至2 mL冻存管，编号放于-80℃低温条件下保存。标本4 ℃解冻，用超纯水1∶3稀释，制成粪便浆。使用ZR-96粪便DNA试剂盒，分离DNA。提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行高通量测序。对原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列（Tags），并将优化序列進行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类。

2.3 炎性因子、RA相关抗体及骨代谢标志物检测 使用EDTA抗凝管收集研究对象晨起后的空腹肘静脉血2管5 mL，于30 min内送至检验科分别检测相关指标。采用静置法检测红细胞沉降率（ESR），免疫扩散法检测C反应蛋白（CRP），酶联免疫吸附法（ELISA）检测类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）等相关抗体、25-羟维生素D、甲状旁腺激素（PTH）、骨钙素（BGP）、总Ⅰ型胶原氨基端前肽（PINP）、β胶联降解产物等骨代谢标志物（β-CTX），络合滴定法检测CA水平。

2.4 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，3组间数据比较采用方差分析；计数资料采用χ2检验。肠道菌群测序资料通过R语言进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析，Wilcox秩和检验进行组间差异显著性分析、主坐标分析（PCoA）、LEfSe分析、Spearman相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 3组ESR、CRP、RF、抗CCP抗体比较 3组ESR、CRP、RF、抗CCP抗体比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3.2 3组血清骨代谢标志物比较 3组β-CTX、PINP、CA、25-羟维生素D水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。3组PTH、BGP比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3.3 3组间肠道菌群比较

3.3.1 3组肠道菌群OTUs聚类比较 对所有样本的有效数据以97%的一致性进行OTUs聚类，共得到477个OTUs。其中RA合并OP组470个OTUs，RA骨量减少组473个OTUs，健康对照组472个OTUs。对其进行Alpha多样性分析，差异无统计学意义（P > 0.05）。

3.3.2 3组肠道菌群构成比较 健康对照组肠道菌群门水平上厚壁菌门（Firmicutes）/拟杆菌门（Bacteroidetes），即F/B显著高于RA合并OP组与RA骨量减少组（P < 0.05）；而RA合并OP组与RA骨量减少组F/B差异无统计学意义（P > 0.05）。RA骨量减少组相较于RA合并OP组，疣微菌门偏多，而变形菌门偏少。见图1。3组之间进行Wilcox秩和检验，P = 0.001，提示3组间菌群构成上存在差异。PCoA分析能直观表现出3组分别有不同的聚集倾向，表明3组肠道菌群结构存在差异。见图2。

3.3.3 3组生物标志物比较 LEfSe能够在不同组间寻找具有统计学差异的生物标志物（Biomarker）。健康对照组生物标志物为p-Firmicutes、g-Megamonas（巨单胞菌）、g-Agathobacter，RA合并OP组为o-Enterobacteriales、f-Enterobacteriaccae，RA骨量减少组为s-Bacteroides-plebeius。默认LDA值筛选值为4，LDA值 ﹥4为差异有统计学意义。见图3。

3.3.4 相关性分析 3组间BGP、CA、RF、抗CCP抗体、PTH、25-羟维生素D、PINP、β-CTX与肠道菌群进行Spearman相关性检验，得到相关性分析热图。见图4。Megamonas、Agathobacter、Roseburia与RF存在负相关（P < 0.05）；Ruminococcaceae-UCG-002、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae与RF呈正相关（P < 0.05），Agathobacter与抗CCP抗体呈负相关（P < 0.05），Ruminococcaceae-UCG-002与抗CCP抗体呈正相关（P < 0.05）；Ruminococcaceae-UCG-002、Parabacteroldes与β-CTX呈正相关（P < 0.05），Megamonas、Bifdobacterium、Ruminococcus-2与β-CTX呈负相关（P < 0.05），Escherchia-Shigella与PINP呈正相关（P < 0.05），Lachnoclostridium与PINP呈负相关（P < 0.05），Lachnospira与PTH呈负相关（P < 0.05），Escherchia-Shigella与25-羟维生素D呈负相关（P < 0.05），Agathobacter与25-羟维生素D呈正相关（P < 0.05），BGP、CA水平与肠道菌无明显相关性（P ﹥ 0.05）。将该结果与LEfSe分析结果相结合，最终得出Megamonas可能与RF、β-CTX呈负相关；Agathobacter与RF、抗CCP抗体呈负相关（P < 0.05），而与25-羟维生素D呈正相关；大肠埃希菌与PINP呈正相关（P < 0.05），而与25-羟维生素D呈负相关（P < 0.05）。

4 讨 论

RA合并OP的发生率约56.67%，明显高于我国65岁以上人群的OP发生率（32.0%）［6］。RA存在破骨细胞的过度活化，在骨破坏中起到关键性作用。β-CTX是一种骨破坏产物，可作为骨破坏程度指标。本研究中RA患者血清β-CTX水平升高，说明RA患者存在较高骨破坏水平，且OP组高于非OP组。PINP为骨合成标志物，当PINP增加，提示骨合成代谢水平升高。本研究发现，RA合并OP组的PINP较健康对照组增加，提示可能与RA合并OP时破骨细胞活化使骨破坏增加，从而代偿性增加骨合成，而RA不同骨代谢水平组间未见明显差异，可能与骨合成水平代偿性增加水平远低于机体骨破坏作用水平相关。BGP由成骨细胞合成，血中BGP水平能反映成骨细胞的活性，可反映骨代谢及骨转换水平，国外一項研究发现RA患者BGP升高［7］。在本研究中，组间血清BGP水平无明显差异。CA可反映机体外周血中钙水平，间接反映骨代谢情况。本研究发现，RA合并OP组CA较健康对照组显著降低，可能与肠道内钙吸收减少及体内钙流失增加相关。25-羟维生素D为脂溶性维生素，羟化后形成1，25-二羟维生素D3，主要功能是促进小肠黏膜对钙和磷的吸收，促进肾小管对钙磷重吸收，同时促进新骨生成。本研究中RA患者25-羟维生素D显著低于健康对照组，影响CA吸收及新骨形成。另外，PTH、BGP组间比较，差异无统计学意义（P < 0.05）。

当自身免疫性疾病活动时，机体处于慢性炎症状态，体内免疫细胞被激活，可产生大量破骨细胞因子［如核转录因子-κB受体活化因子配体（RANKL）、白细胞介素-1、白细胞介素-17、肿瘤坏死因子-α］，使骨质破坏增加。一项小鼠实验发现，慢性炎症组小鼠破骨细胞能激活CD4+ T细胞产生炎性因子［8］。研究发现，RANKL水平与CRP水平呈正相关［7］。本研究检测了CRP等炎性指标水平，发现RA患者炎性指标远高于健康对照组，提示机体慢性炎症状态下激活机体免疫，从而影响骨代谢水平。

肠道内部定植的所有共栖、共生及致病微生物被称为肠道菌群。在出生时，人体内肠道菌群几乎完全来自于母体，后续随着饮食、疾病、药物等环境变化而变化［9］。肠道菌群会影响机体内环境，并促进体内维生素、蛋白质、钙等营养物质合成，成为肠道的天然屏障［10］。当发生菌群失调时，肠道菌群失去原有的保护功能，肠道黏膜屏障破坏，不能有效阻止病原菌进入机体。致病菌侵袭机体后，细菌细胞壁的肽聚糖成分促进细胞因子的产生及释放，而这可能是诱发RA发病的一个重要因素［11］。HAMILTON等［12］证明，改变肠道菌群失调可诱导肠道黏膜通透性增加，血清脂多糖（LPS）水平增加。而LPS增加使黏膜通透性进一步增加，最终导致肠道细菌毒素吸收入血，使机体处于慢性炎症状态或引起内毒素血症，诱发RA及骨代谢紊乱。从而证明，肠道菌群结构紊乱一方面能诱发RA的发生；另一方面，通过菌群移位，细菌及其代谢产物入血，机体免疫处于激活状态，产生炎性因子，使机体处于慢性炎症状态，从而使疾病进展。以原发性OP为研究对象，通过肠道菌16S rRNA扩增、测序、生物信息学分析一项研究发现，OP组相较于正常组，在菌群丰富度及菌群结构上均存在差异，得出OP状态下的肠道菌群多样性较正常组明显不同［13］。研究发现，肠道菌群的存在及其多样性与骨代谢密切相关［14］。进而提出“骨微生物学”这一概念，指微生物群在骨骼健康中的作用，以及微生物群调节骨骼发育、骨骼老化和病理性骨丢失的机制［15］。关于肠道菌群通过何种机制影响RA及OP的发生、发展，目前仍处于探索阶段。本实验发现，肠道菌群结构在RA与健康对照组间存在明显差异；同时，RA骨代谢水平不同，肠道菌群结构分布也存在明显不同。提示肠道菌群可能与RA及骨代谢存在相关性。进行相关性分析得到相关性热图，发现β-CTX与肠道菌群存在相关性，且与RF、抗CCP抗体存在关系，提示RA患者肠道菌群改变可能参与骨代谢异常，增加骨破坏，从而导致OP。在对90例患者进行的横断面研究中，试验者收集RA患者血清标本，通过酶联免疫吸附法检测患者抗CCP抗体，并测定ESR、RF、DAS28评分等，对其进行相关性分析，发现抗CCP抗体滴度与DAS28评分之间存在相关性［16］，

提示抗CCP抗体滴度的高低可反映体内炎症水平。本研究还发现，肠道菌群与RA相关抗体存在相关性，可能是菌群结构改变影响抗体滴度，通过影响疾病活动度间接对骨代谢发挥作用。肠道菌群与RA相关性抗体、骨代谢标志物相关，寻找其相关差异菌可作为RA合并OP一个治疗靶点，为今后RA合并OP行调节肠道菌群治疗提供理论依据。

综上所述，RA患者存在肠道菌群结构紊乱，且骨代谢水平不同菌群构成存在差异。肠道菌群结构紊乱可能参与RA合并OP发病，目前关于肠道菌群诱发RA及OP的机制仍待进一步研究。另外，本研究所涉样本量较少，且饮食习惯存在地域差别，需要多地域更大的样本量进行证实研究。

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