不同生长年限虎杖高效液相色谱指纹图谱研究

何凤云，彭珊艳，周爽，李有富

（湖北省襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441000）

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎和根，味微苦，性微寒，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效，用于治疗湿热黄疸、淋浊、带下、风湿痹痛、痈肿疮毒、水火烫伤、经闭、癥瘕、跌打损伤及肺热咳嗽［1］。虎杖具有抗感染、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、脂质调节、改善阿尔茨海默病、预防艾滋病等药理学作用［2-3］，主要含有蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、香豆素类及脂肪酸类化合物［4］。其中，二苯乙烯类化合物主要包括虎杖苷和白藜芦醇等［5］；游离型蒽醌类化合物主要包括大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等；黄酮类化合物主要包括芦丁、槲皮素、黄酮等；白藜芦醇在保护心血管、聚集血小板、保护肝脏组织等方面疗效显著［6］；虎杖苷具有抗动脉粥样硬化［7］、保护肝脏［8］和肾脏［9］、抗痛风［10］及抑制宫颈癌Hela细胞生长［11］等功效；大黄素甲醚被作为一种新型植物源农药使用［12］。2020年版《中国药典（一部）》中仅规定春、秋二季采挖，对虎杖的生长年限、采收时间等无明确要求。研究显示，虎杖采收时间为有性繁殖后至次年3月至4月或11月［13］。已有文献仅报道生长年限对虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和大黄素甲醚4种有效成分含量的影响研究［14］，尚无不同生长年限虎杖高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的研究。虎杖为多年生草本植物，其品质与生长年限密切相关，二苯乙烯类和蒽醌类等主要药效成分呈动态变化［15］。故确定不同生长年限虎杖指纹图谱的差异，并采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）法等化学计量学方法精准预测与识别生长年限，对保障虎杖的质量保证临床用药的安全和有效至关重要［16］。本研究中建立了不同生长年限虎杖的HPLC指纹图谱，并结合PLS-DA法分析其中化学成分含量的差异，以为虎杖的采收及质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Alliance acquity e2695型高效液相色谱系统（美国沃特世公司），配有e2695型分离单元、2998型光电二极管阵列检测器（PDA）；Secura125-1CN型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为0.01 mg）；JP-100PLUS型高功率超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）；JC-FW-100型高速小型粉碎机（青岛聚创环保集团有限公司，功率为800 W，转速为26 000 r/min）。

1.2 试药

白藜芦醇对照品（批号为111535-201703，含量为99.4%），大黄素对照品（批号为110756-201913，含量为96.0%），大黄素甲醚对照品（批号为110758-201817，含量为99.2%），均购自中国食品药品检定研究院；虎杖苷（成都曼思特生物科技有限公司，批号为A0052，含量≥99%）；乙腈、甲醇均为色谱纯，甲酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水；虎杖采收于湖北省十堰市房县虎杖种植基地，采收时间分别为移植后第1年（编号为S1-S5）、第2年（编号为S6-S10）、第3年（编号为S11-S15）、第4年（编号为S16-S20）、第5年（编号为S21-S25），均为11月，各5批次，经湖北省襄阳市中心医院李有富副主任药师鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相［17］：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～7 min时10%A，7～20 min时10%A→25%A，20～25 min时25%A→45%A，25～35 min时45%A→60%A，35～50 min时60%A，50～60 min时60%A→90%A，60～65 min时90%A→10%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：286 nm；柱温：25℃；进样量：20µL。

2.2 溶液制备

取虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成质量浓度分别为220.63，217.58，254.36，229.17µg/mL的混合对照品溶液。样品去杂质，洗净，润透，切厚片，干燥，粉碎，过3号筛，取细粉1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%乙醇溶液40 mL，称定质量，90℃水浴超声处理50 min［18］，放冷至室温，再称定质量，用50%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取样品（编号为S1）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定6次，以8号峰（白藜芦醇）为参照峰。结果其他各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.58%和0.67%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S1）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，室温放置0，4，8，12，16，24 h时，按2.1项下色谱条件进样测定，以8号峰（白藜芦醇）为参照峰。结果其他各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.43%和1.17%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（编号为S1）适量，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以8号峰（白藜芦醇）为参照峰。结果其他各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.37%和1.62%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立

指纹图谱建立：取25批样品（编号为S1-S25），按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。将不同生长年限虎杖的HPLC图分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版软件，以样品（编号为S1）色谱图为参照图谱，设置对照图谱生成方法为中位数法，时间窗宽度为0.1，采用多点校正法进行全峰匹配，得到19个共有峰，且色谱峰保留时间一致。详见图1。

相似度评价：将25批样品HPLC指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版软件，以相关系数代表相似度，分别计算各生长年限虎杖的相似度。结果见表1。

表1 25批虎杖相似度评价结果Tab.1 Similarity evaluation results of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

共有峰指认：通过与混合对照品溶液色谱峰比对，共指认出4个共有峰，分别为6号峰（虎杖苷）、8号峰（白藜芦醇）、17号峰（大黄素）、18号峰（大黄素甲醚）。详见图2。

相对保留时间和相对峰面积计算：由图1可知，8号峰（白藜芦醇）保留时间较居中，与相邻色谱峰分离度较好，响应值适中，故作为参照峰计算其他共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果分别为0.39%～1.48%和7.66%～32.51%。结果表明，5个生长年限虎杖的共有峰保留时间相对稳定，但化学成分峰面积相差较大。

图1 25批虎杖高效液相色谱指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

6.虎杖苷8.白藜芦醇17.大黄素18.大黄素甲醚图2混合对照品溶液高效液相色谱图6.Polydatin 8.Resveratrol 17.Emodin 18.PhyscionFig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.6 PLS-DA

将19个共有峰峰面积导入SIMCA-P 14.1软件，以此为变量进行PLS-DA，提取前5个主成分，自变量（X）模型解释率参数（R2X）值和因变量（Y）模型解释率参数（R2Y）值分别为0.980和0.984，模型预测能力参数（Q2Y）值为0.974（＞0.5），表明所建模型的稳定性及预测能力均较强。置换检验结果显示，累积方差值（R2）和累积交叉有效性值（Q2）分别为0.172和-0.494，表明所建模型不存在过拟合，能有效判别不同生长年限虎杖HPLC指纹图谱的差异。经PLS-DA模型分析，分别获得得分散点图（图3）、载荷散点图（图4）和变量重要性投影（VIP）图（图5）。

图3 25批虎杖的PLS-DA得分散点图Fig.3 PLS-DA scoring plot of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

由图3可知，所有点均在95%置信区间内，表明不同生长年限虎杖化学成分相似，根据生长年限不同明显聚为5类，表明不同生长年限虎杖化学成分含量存在差异。图4中每1个点代表1个共有峰，偏离原点越远，对模型的权重越大，对区分各批次样品的作用越大。VIP值可直观反映共有峰对样品差异的权重，VIP＞1，即为差异标记物。由图4和图5可知，共筛选出6个差异标记物，按影响大小依次为峰15＞峰6（虎杖苷）＞峰8（白藜芦醇）＞峰17（大黄素）＞峰5＞峰1。

图4 25批虎杖的PLS-DA载荷散点图Fig.4 PLS-DA loading plot of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

图5 25批虎杖的PLS-DA VIP图Fig.5 PLS-DA VIP plot of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

3 讨论

3.1 提取方法优化

根据相关提取工艺［19-20］，曾考察不同提取方式（超声和回流）、不同提取溶剂（不同浓度的乙醇和甲醇）、不同提取时间、不同提取温度及不同料液比等因素对HPLC指纹图谱共有峰提取效果的影响，以提取方法的重复性，结果的准确性及HPLC指纹图谱色谱峰数量、响应值为指标，最终确定2.2项下供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件考察

采用PDA对供试品溶液进行全波长扫描分析，结果在286 nm波长处各成分峰形较好，共有峰数量较多，响应值较大，可满足HPLC指纹图谱建立要求，故选择286 nm为检测波长。二苯乙烯类和蒽醌类成分均为多羟基化合物，具有一定酸性，故着重考察乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液3种不同体系的流动相，结果以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相时虎杖的HPLC指纹图谱色谱峰峰形及分离效果较理想，故选择此流动相。

3.3 结果分析

本研究中分别以不同生长年限的样品（编号分别为S1，S6，S11，S16，S21）的HPLC图作为参考图谱，共有峰数量和相似度结果均一致；以样品（编号为S1）的色谱图为参考图谱，25批虎杖HPLC指纹图谱相似度为0.906～0.993，提示HPLC指纹图谱可表示不同生长年限虎杖的特征。19个共有峰相对峰面积的RSD为7.66%～32.51%，差异较大，提示不同生长年限虎杖的化学成分含量存在差异。由HPLC指纹图谱及色谱峰峰面积可知，虎杖苷和白藜芦醇峰面积均在第2年最大；大黄素和大黄素甲醚峰面积均在第3年最大。经PLS-DA分析可知，5个不同生长年限虎杖样品分别聚为5类，影响聚类结果的主要化合物依VIP大小分别为峰15、峰6（虎杖苷）、峰8（白藜芦醇）、峰17（大黄素）、峰5、峰1。峰1、峰5及峰15的定性分析，6个差异标记物的定量分析及在不同生长年限中的含量变化规律，以及与虎杖药效学的相关性研究仍需借助液质联用、核磁共振等手段进一步研究。同时，本研究中发现，产地、采收期、含水量等因素对虎杖的HPLC指纹图谱影响较大，故需建立各个因素的分析方案，以更全面地为虎杖的采收及质量研究提供参考。