蒲丁颗粒剂的定性鉴别与总黄酮含量测定

刘 辉 杨庆芳

蒲丁合剂是浙江中医药大学附属第二医院沿用多年的经验方，医院制剂室将其制成合剂应用于临床，疗效确切，本合剂由紫花地丁、蒲公英组成，用于治疗热毒所致的急慢性扁桃体炎、上呼吸道感染、腐肿疮疖及咽喉炎等。中药传统合剂是我国应用较早、较广泛的剂型，然而其贮存不易、携带不便等缺点，严重制约了其在临床上的应用和发展[1-2]。为克服以上缺点，在合剂的基础上，优选出蒲丁颗粒的最佳水提，纯化工艺；并通过一系列优选实验，筛选辅料的种类和用量，确定蒲丁颗粒的成型工艺。同时，对蒲丁颗粒的质量标准进行研究，处方中的蒲公英药材可采用薄层色谱法[3-4]进行鉴别，并运用紫外分光光度法[5-6]对总黄酮进行含量测定，提高制剂的质量评价系统。

1 仪器与试药

1.1 仪 器 硅胶G 板（青岛海洋化工），ZF-20D暗箱式-紫外分析仪（巩义市予华仪器有限责任公司上海分公司），CT-C 型热风循环烘箱（江苏先锋干燥工程有限公司），XS105DU 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），UV-2550 紫外分光光度计（岛津仪器有限公司）。

1.2 实验试药 蒲丁颗粒（实验室自制）；咖啡酸对照品（批号110885-201802）、蒲公英对照药材（批号121195-201904）、紫花地丁对照药材（批号121429-201906）、芦丁对照品（批号100080-201812），中国食品药品检定研究院；甲醇试剂（批号2019021002）、乙酸乙酯试剂（批号2019040202）、乙醇试剂（批号2019051502）等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 TLC 薄层色谱法蒲丁颗粒中蒲公英的鉴别

2.1.1 供试品溶液、对照蒲公英药材溶液及阴性对照液的制备 分别精密称定蒲丁颗粒1 g 及蒲公英对照药材2 g，加入20 mL 5%甲酸的甲醇溶液中超声20 min，滤过后蒸干，残渣中加入10 mL 水使其溶解，滤过后滤液经2 次乙酸乙酯提取，每次10 mL，将两次提取液混合后蒸干，用1 mL 甲醇将残渣溶解，作为供试品溶液及对照蒲公英药材溶液。取除蒲公英以外的其他药材，按蒲丁颗粒制剂工艺制备阴性颗粒。取阴性颗粒，按以上方法制成阴性对照液。

2.1.2 咖啡酸对照品溶液制备 取咖啡酸对照品，加甲醇配制成浓度为0.5 mg/mL 对照溶液。

2.1.3 对照紫花地丁药材溶液及不含紫花地丁阴性对照液的制备 分别精密称定蒲丁颗粒2 g 及紫花地丁对照药材2 g，加甲醇20 mL，超声20 min，过滤，滤液蒸干，残渣加热水10 mL，搅拌使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液及紫花地丁对照药材。取除紫花地丁以外的其他药材，按蒲丁颗粒制剂工艺制备阴性颗粒。取阴性颗粒，按以上方法制成阴性对照液。

2.1.4 蒲公英TLC 薄层色谱鉴别 按照《中国药典》薄层色谱法试验通则要求，精密量取供试液、蒲公英对照药材溶液、咖啡酸对照品、不含蒲公英阴性供试品各2 μL，点样于相同硅胶板上，以甲酸-乙酸乙酯-甲苯（1∶3∶5）的上层液作为展开剂将样品展开，取出后置于适当位置晾干，波长365 nm 紫外灯下进行检视。相应位置显相同的咖啡酸亮色斑点，不含蒲公英阴性供试品无斑点。见图1。

图1 蒲丁颗粒中蒲公英色谱图

2.1.5 紫花地丁TLC 薄层色谱鉴别 按照《中国药典》薄层色谱法试验通则要求，精密量取供试液、紫花地丁对照药材溶液、不含紫花地丁阴性供试品各4 μL，点样于相同硅胶板上，以甲酸-乙酸乙酯-甲苯（1:3:5）的上层液作为展开剂将样品展开，取出后置于适当位置晾干，波长365 nm 紫外灯下进行检视。相应位置显相同的亮色斑点，不含蒲公英阴性供试品无斑点。见图2。

图2 蒲丁颗粒中紫花地丁色谱图

2.2 蒲丁颗粒中总黄酮含量测定

2.2.1 供试液制备 称定蒲丁颗粒0.25 g，至25 mL容量瓶，加60%乙醇20 mL 溶解，超声处理45 min后放冷，稀释至刻度后定容摇匀，过滤溶液即得。

2.2.2 标准溶液制备 称定芦丁标准品20.0 mg，加入60%乙醇液使溶解，于100 mL 容量瓶中定容。准确吸取25 mL 至50 mL 容量瓶中，加60%乙醇液稀释至刻度后定容摇匀，即得0.100 mg/mL 芦丁稀释液。

2.2.3 紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量 照紫外-可见分光光度法（通则0401），在413 nm 波长处测定吸光度，精密量取供试品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，加入0.5%三氯化铝无水乙醇液5 mL，测定吸光度并按测定吸光度从标准曲线上计算出供试品溶液中总黄酮的含量，即得。

2.2.4 标准曲线及线性关系 分别准确吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 标准溶液至25 mL 量瓶中，加入三氯化铝无水乙醇液（浓度0.5%）5 mL，再加入60%无水乙醇液至刻度，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在413 nm 波长处测定吸光度，质量（根据浓度求得质量为0.0985 mg、0.1970 mg、0.2955 mg、0.3940 mg、0.4925 mg、0.5909 mg）为横坐标，以对应吸光度A（0.107、0.219、0.324、0.425、0.535、0.629）为纵坐标，得线性方程为Y=1.0615X+0.0073，相关系数R2=0.9995，表明芦丁在0.0985～0.5909 mg/mL 范围具有良好的线性关系。

2.2.5 重复性考察 取同一份对照品溶液，于413 nm处测定吸光度值，重复5 次，结果RSD 为0.54%，＜2.0%，符合要求。

2.2.6 稳定性考察 取相同供试品溶液，分别于0.5、1、2 h，测定一次吸收值，结果RSD 为0.65%，＜2.0%，符合要求。

2.2.7 精密度 取同一批样品，按照相同方法制备6份供试液，进行含量测定，结果RSD 为1.41%，＜2.0%，符合要求。

2.2.8 加样回收率实验 取同一批样品，精密称取约0.125 g 加入芦丁对照品溶液6 mL，至25 mL 量瓶，混合均匀，加60%乙醇15 mL 溶解，超声处理45 min 后放冷，稀释至刻度后定容摇匀，过滤溶液即得。取上清液备用。上清液同法处理。本法回收率为106.6%，在92%～110%之间，符合要求。见表1。

表1 加样回收率实验结果

3 讨论

蒲丁颗粒由蒲公英和地丁组成，蒲公英中包含的有机酸主要有绿原酸、咖啡酸、齐墩果酸等具有抗菌、消炎、抗病毒、利胆保肝、降血脂等药理作用[7]。文献报道，对咖啡酸的研究也比较成熟，本实验中采用薄层层析法以咖啡酸为参比制剂鉴别蒲丁颗粒，预实验显示其专属性也很强，可以作为蒲丁颗粒定性鉴别的参比制剂[8]。研究显示，蒲公英及紫花地丁中均含有总黄酮[7，9]。芦丁作为总黄酮含量测定参比制剂的研究也比较成熟，根据实验室条件进行预实验，结果显示，紫外分光光度法对其含量的测定的线性、重复性、精密度、回收率及稳定性验证结果均较好。以上结果表明，可以采用该方法测定蒲丁颗粒中总黄酮的含量。