不明原因复发性流产患者绒毛组织中hsa-miR-125a-5p及其靶基因表达的研究

张瑶楠，刘丹，张广志，张蔚*

(1.国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081；2.北京市海淀区妇幼保健院，北京 100080)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)指育龄期妇女与同一性伴侣连续发生3次及以上的自然流产，大多数专家认为连续发生2次流产即应重视并进行评估，因为其再次流产的风险与已连续发生3次者相近[1]。RSA常见原因有胚胎染色体异常、子宫解剖结构异常、免疫功能异常、内分泌紊乱、血栓前状态等。排除这些已知因素后的RSA由于病因不明，称为不明原因RSA(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)，约占RSA的50%左右[2]。这些患者因病因不明确得不到有效治疗，由此产生沉重的心理和社会负担。因此，探索URSA的发病机制，为该病的治疗和预防提供科学依据具有十分重要的意义。

课题组前期高通量测序结果发现，URSA患者与正常对照组的绒毛组织中有一些差异表达的微小RNA(miRNAs)，其中包括hsa-miR-125a-5p，它在不明原因复发性流产患者绒毛组织中表达上调；经过生物信息学分析预测到基质金属蛋白酶2(MMP-2)是hsa-miR-125a-5p的可能靶基因(未发表内部资料)。有细胞实验也提示MMP-2是hsa-miR-125a-5p的靶基因[3]。本研究通过增加样本量对URSA患者绒毛组织中hsa-miR-125a-5p的表达情况进行验证，并检测其可能靶基因MMP-2在不明原因复发性流产患者和正常对照组的绒毛组织中的表达差异，来探讨hsa-miR-125a-5p与URSA的可能关系。

材料与方法

一、研究对象及分组

收集2020年1月至2021年10月期间在北京市海淀区妇幼保健院计划生育科因胚胎停育就诊的25例URSA患者为URSA组。

纳入标准：20岁≤年龄<40岁；血β-HCG检测和彩超证实为宫内妊娠；B超提示胚胎停育，临床诊断稽留流产；流产时间在妊娠12周内；既往有2次及以上自然流产史。

排除标准：合并生殖器官解剖结构异常、患者夫妇或胚胎染色体异常、内分泌疾病、免疫功能异常、感染等可能引起流产的疾病或因素。

按照年龄和停经时间进行匹配，选取同期28例自愿要求终止妊娠的正常早孕妇女作为对照组。纳入标准：既往无流产史；血β-HCG检测和彩超均为正常早孕，无先兆流产症状。

两组研究对象均排除生殖器官解剖结构异常、染色体异常、内分泌异常、免疫异常、感染等疾病和因素。

本研究通过国家卫生健康委科学技术研究所伦理委员会批准。所有患者均进行知情同意。

二、研究方法

1.标本收集：所有患者行负压吸引流产术终止妊娠，术后留取绒毛组织。生理盐水漂洗后分为2份，一份置于液氮中速冻，置于冻存管保存于-80℃冰箱；一份置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片。

2.实时荧光定量PCR法检测绒毛组织hsa-miR-125a-5p表达：取绒毛组织，研磨后使用miRNeasy MicroKit(QIAGEN，德国)提取、纯化绒毛中的miRNA。使用紫外分光光度计检测样本纯度，A260/280≥1.80为合格样品。采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara，日本)将绒毛 miRNA反转录成为cDNA。采用TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus；Takara，日本)进行实时荧光定量PCR，U6为内参照基因。使用StepOneTM实时定量PCR系统(ThermoFisher，美国)进行实时荧光定量PCR反应，PCR反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，总共40个循环；95℃ 5 s、60℃ 1 min，95℃ 1 min。反应中每个样本设3个复管，取平均值。使用StepOneTMsoftware v2.1软件对结果进行分析，应用2-△△Ct法计算hsa-miR-125a-5p的相对表达量。

3.实时荧光定量PCR法检测绒毛组织MMP-2 mRNA表达水平：采用Trizol法提取绒毛组织中的总mRNA，采用SMART MMLV Reverse Transcriptase(Takara，日本)将绒毛mRNA反转录成为cDNA。采用TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus；Takara，日本)进行实时荧光定量PCR，GAPDH为内参照基因。使用StepOneTM实时定量PCR系统(ThermoFisher，美国)进行实时荧光定量PCR反应，PCR反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 31 s，总共40个循环；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 1 min。反应中每个样本设3个复管，取平均值。使用StepOneTMsoftware v2.1软件对结果进行分析，应用2-△△Ct法计算MMP-2 mRNA表达量。引物由英潍捷基公司合成(表1)。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

4.免疫组化法检测绒毛组织MMP-2蛋白表达水平：对绒毛组织石蜡切片进行脱蜡、水化处理后滴加3%的H2O2室温孵育10 min；加入柠檬酸盐溶液，高压2.5 min，对切片组织进行修复；滴加鼠抗人MMP-2单克隆抗体(Abcam，英国)，按照1∶200稀释，4℃反应过夜；PBS缓冲液洗，滴加酶标羊抗鼠IgG聚合物(北京中杉金桥)，37℃反应30 min，PBS缓冲液洗；滴加DAB显色液反应5 min，纯水冲洗，复染；切片进行脱水、透明后用中性树胶封片。

随机选取6个视野观察并扫描拍照，使用Image-Pro Plus 6.0软件对绒毛组织MMP-2蛋白水平进行定量分析，采用积分光密度(IOD=平均光密度×阳性面积)表示蛋白表达水平。

三、统计学分析

结 果

一、研究对象基本情况比较

本研究纳入25例URSA患者流产绒毛组织(URSA组)以及同期28例自愿要求终止妊娠的正常早孕妇女绒毛组织(对照组)。

URSA组患者年龄23～40岁，停经时间42～77 d；对照组患者年龄23～40岁，停经时间35～77 d；两组患者的平均年龄、平均停经时间及体质量指数(BMI)等基本资料比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组基本情况比较(-±s)

二、研究对象绒毛组织hsa-miR-125a-5p和MMP-2 mRNA表达量比较

URSA组患者绒毛组织中hsa-miR-125a-5p的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，而MMP-2 mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.05)(表3)。

表3 两组间绒毛组织hsa-miR-125a-5p和MMP-2 mRNA表达量比较(-±s)

三、生物信息学软件预测hsa-miR-125a-5p靶基因

使用miRanda软件预测hsa-miR-125a-5p的靶基因，参数为：S≥140、ΔG≤-20 kcal/mol。结果显示，hsa-miR-125a-5p的编码区域中8个碱基与MMP-2的3’-非翻译编码区(UTR)的碱基互补；预测hsa-miR-125a-5p可作用于MMP-2的3’-UTR，参与MMP-2的转录调控。提示MMP-2是hsa-miR-125a-5p的潜在靶基因(图1)。

图1 hsa-miR-125a-5p与MMP-2的预测作用位点

四、两组患者绒毛组织形态结构及MMP-2蛋白水平表达比较

对照组绒毛组织形态规则，大小一致，滋养层细胞结构完整、排列整齐(图2A)；URSA组绒毛组织形态不规则，大小不一，滋养层细胞结构不完整、排列混乱，外层合体滋养层细胞数量减少(图2C)；MMP-2主要表达在合体滋养层细胞胞质中(图2B、2D)；URSA组患者绒毛组织中MMP-2蛋白的表达量显著低于对照组[(11.15±3.11) vs.(71.67±18.05)，P<0.05)(图2B、2D，图3)。

A、B：对照组(B为A方框区域放大图)；C、D：URSA组(D为C方框区域放大图)；CT 细胞滋养层、SN 合体滋养层。图2 绒毛组织中MMP-2蛋白染色结果(免疫组化染色；A/C ×200，B/D ×400)

与对照组比较，*P<0.05图3 两组绒毛组织MMP-2蛋白表达量比较

讨 论

在妊娠发生的过程中，囊胚着床后合体滋养层细胞侵入子宫蜕膜并参与子宫螺旋动脉的重塑，进而形成胎盘组织为胚胎的发育提供营养支持。因此，滋养层细胞侵入子宫蜕膜是胎盘形成的关键一步，如果滋养层细胞侵袭受损就会导致流产的发生。

在滋养层细胞侵袭子宫内膜的过程中，基质金属蛋白酶(MMPs)由于可以降解细胞外基质、参与细胞外基质的重构，发挥着重要的作用[4]。其中MMP-2是妊娠早期滋养层细胞成功侵袭子宫内膜的关键酶[5]，可以降解细胞外基质中的胶原蛋白，促进滋养层细胞入侵子宫内膜基质，保证胎盘形成和妊娠的维持[6]。研究发现，自然流产、先兆子痫、妊娠滋养细胞疾病等异常妊娠患者的胎盘组织及血液中MMP-2表达异常[4，7-8]。

本研究结果显示，对照组绒毛组织形态规则、大小均一、外层合体滋养层细胞及内层细胞滋养层细胞结构完整，排列整齐；而URSA组绒毛组织形态不规则，滋养层细胞结构不完整、排列混乱、外层合体滋养层细胞数量减少。URSA组绒毛组织MMP-2 mRNA相对表达量及蛋白表达水平均显著低于对照组，提示URSA患者滋养层细胞分化出现异常，滋养层薄弱，MMP-2表达减少从而滋养层细胞的侵袭能力下降[9]。

MMP-2受多种细胞因子的调控，其中一种调控因子就是miRNA。miRNA是一种内源性非编码小RNA，通过互补的方式与其靶mRNA的3’-UTR结合，对靶基因起到降解或抑制的作用，从而调控靶基因的表达。本研究通过生物信息学分析预测到MMP-2是hsa-miR-125a-5p的靶基因，hsa-miR-125a-5p可作用于MMP-2的3’-UTR，参与MMP-2的转录调控。

miR-125a是miR-125家族中的一员，根据其转录方向不同可产生两种成熟miR-125a，即miR-125a-3p 和miR-125a-5p。研究发现，其在肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等多种疾病中发挥重要功能，对细胞的增殖、转移、分化及凋亡起重要作用[10-13]。在早期胚胎停育及正常早孕绒毛组织滋养层细胞及间质细胞中也均有miR-125a的表达。研究发现，miR-125a的异常表达可能与自然流产、先兆子痫等异常妊娠有关[14-17]。

课题组前期高通量测序结果发现，hsa-miR-125a-5p在URSA组中表达上调(内部资料)。本研究显示URSA组绒毛组织hsa-miR-125a-5p的相对表达量明显高于对照组，与前期测序结果表达趋势一致，表明hsa-miR-125a-5p确实在URSA患者的绒毛组织中高表达，可能与URSA发病机制有关。朱旗[18]研究发现miR-125a过表达抑制了绒毛膜滋养层细胞的增殖与迁移，细胞代谢活性降低，从而导致胚胎停育的发生。本研究中URSA组绒毛组织hsa-miR-125a-5p表达显著上调，而其可能靶基因MMP-2的表达显著下调，推测hsa-miR-125a-5p过表达抑制了MMP-2的表达，从而导致胚胎滋养层细胞的侵袭能力下降，胚胎侵入子宫蜕膜能力受损，胚胎着床过浅，胎盘形成不良，影响妊娠的持续，导致复发性流产。

综上，根据研究结果推测URSA患者绒毛滋养层细胞hsa-miR-125a-5p表达上调抑制了其可能靶基因MMP-2表达从而导致滋养层细胞的侵袭能力下降，胚胎侵入子宫蜕膜能力受损，引发胚胎停育，为URSA的可能发病机制提供了研究思路。未来需加大样本量对这一可能机制进行深入的探索和研究。