Catsup通过调控细胞内锌水平影响雌性果蝇生殖的机制研究

高 燕,韦 田,纪晓雯,李广莹,肖桂然

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

锌是第二大微量元素,参与多个细胞代谢过程,如基因表达、DNA合成、蛋白质合成、免疫功能、伤口愈合和细胞分裂[1]。锌还对孕期、儿童和青少年时期的生长发育至关重要[2]。但人体没有专门的锌存储系统,因此需要每天摄入锌维持机体稳态平衡[1]。已有一些研究发现锌与生殖密切相关。在雄性生殖系统中,睾丸、附睾、前列腺以及精液中锌含量较多[3]。当机体锌离子水平较低时,雄性机体会出现异常,如生长发育迟缓、性成熟推迟、免疫功能降低、精子活力降低等[3]。此外,研究发现机体中锌离子稳态失衡也会影响雌性生殖系统的发育。当锌离子摄入不足时会影响卵母细胞的质量、卵母细胞分裂、排卵异常等[4-5],还会影响卵巢发育,甚至造成雌性难产、卵巢萎缩等严重影响[6],但具体的机制仍不清楚。

果蝇是遗传学和发育生物学中重要的模式生物之一,具有体积小、生命周期短(约12 d)、繁殖力强、子代数量多等特点[7]。果蝇有2个卵巢,每个卵巢有15～20个卵巢管,在每个卵巢管前端有1个卵原区结构,在卵原区顶端有5～7个帽细胞,前端与端丝细胞相连,后端通过调控细胞黏附蛋白DE-Cadherin将生殖干细胞固定在卵原区,这3种细胞共同构成生殖干细胞微环境(niche)[8]。目前,果蝇卵巢已被用于niche形成、结构维持、干细胞与niche之间作用机制的研究[9]。雌性动物卵巢释放卵子的过程称为排卵,研究发现人类和果蝇等不同动物的排卵方式基本相似,因此果蝇卵巢模型系统适于研究生殖调控机制[10]。

在动物中有solute-linked carrier 39A(SLC39A,ZIP家族)和solute-linked carrier 30A(SLC30A,ZnT家族)[11]2种锌转运蛋白家族调节细胞内锌水平。ZIP家族蛋白负责锌从细胞器或细胞外到细胞质的运输,ZnT家族介导锌从细胞质输出到细胞器或细胞外[12]。生物信息学比对发现,Catsup基因是哺乳动物Zip7基因的同源物,属于ZIP家族的锌转运蛋白,定位于高尔基体,负责将高尔基体中的锌运至细胞质[11]。虽然文献[13-14]报道Catsup突变会导致卵子形成异常,果蝇生殖能力下降,但具体分子机制并不清楚,因此,本文利用Gal4/UAS系统[15]在果蝇卵巢niche中特异性敲低Catsup以研究对生殖发育的影响,并进一步探索分子机制,旨在解析锌对生殖调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 果蝇品系

果蝇饲养于25 ℃、60%湿度、12 h/12 h交替光照的培养箱中,本文所用果蝇品系及来源如下:W1118(来自Vienna Drosophila Research Center,编号60000)、CatsupRNAi(来自Vienna Drosophila Research Center,编号100095)、CatsupRNAi;dZnt7 RNAi(CatsupRNAi和dZnt7 RNAi重组果蝇,其中dZnt7 RNAi来自清华果蝇中心,编号THU5682)、CatsupRNAi;dZip1 OE(CatsupRNAi和dZip1 OE重组果蝇,其中dZip1 OE果蝇来自文献[16])、CatsupRNAi;dZnt1 OE(CatsupRNAi和dZnt1 OE重组果蝇,其中dZnt1 OE果蝇来自文献[17])、C587-Gal4;UAS-EGFP(来自Bloomington Drosophila Stock Center,编号67747)、C587-Gal4，Vkg-GFP/Cyo(来自文献[18])。

1.1.2 果蝇标准玉米培养基

果蝇标准玉米培养基配方如下:玉米粉100 g、红糖40 g、酵母25 g、白糖14.5 g、大豆粉10 g、琼脂8 g,添加超纯水至1 L。

1.1.3 果蝇加药培养基

在标准玉米培养基中添加终浓度4 mmol/L ZnCl2或50 μmol/L TPEN(N,N,N,N-Tetrakis(2-pyridylmethyl)-ethylenediamine)。

1.2 实验方法

1.2.1 生殖能力测定

在25 ℃、60%相对湿度条件下饲养果蝇,将C587;UAS-EGFP处女蝇分别与不同品系的UAS雄蝇杂交,获得子一代果蝇。收集1 d内羽化的雌蝇,放入添加适量酵母的果蝇培养管,每管10只雌蝇和3只雄蝇。饲养约2 d,将雌蝇分别放入添加适量酵母的培养管,每管1只,每个基因型分装10管进行平行实验。每隔24 h将雌蝇导入新管,连续7 d统计产蛋数量,每组产蛋量取平均值,即得每种品系果蝇1周内生殖能力的变化。

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1.2.2 卵巢niche结构的观察

本研究所用的C587-Gal4;UAS-EGFP果蝇是在卵巢niche表达增强绿色荧光蛋白(cenhanced green fluorescent protein,EGFP),用于标记niche部位,便于用荧光显微镜观察niche形态。将C587-Gal4;UAS-EGFP处女蝇分别与不同品系的UAS雄蝇杂交,在25 ℃、60%相对湿度条件下饲养,获得子一代果蝇。收集1 d内羽化的雌蝇放入添加适量酵母的果蝇培养管,饲养3 d,解剖果蝇卵巢,在荧光显微镜下观察卵巢niche结构的变化。

1.2.3 卵巢niche部位胶原蛋白的观察

果蝇Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)由α-1 (Cg25c)和α-2 (Vkg)组成,形成异三聚体翻译后被赖氨酸和脯氨酸羟化酶修饰,最终形成功能性基底膜[19]。在果蝇中,Vkg-GFP是功能性GFP-trap融合到Ⅳ型胶原蛋白 α-2 链(Vkg),全长内源性蛋白从其内源性启动子中表达为Vkg-GFP融合蛋白[20]。利用遗传重组技术获得C587-Gal4,Vkg-GFP果蝇,用荧光显微镜观察卵巢niche组织,可根据绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达(荧光强度)来反映Vkg(胶原蛋白)的表达水平。

1.2.4 卵巢大小的统计

利用Image J软件统计卵巢大小,显著性水平取P<0.05(*)为显著,P<0.01(**),P<0.001(***)。

2 结果与分析

2.1 敲低Catsup对果蝇生殖能力的影响

图1 Catsup表达下调对产蛋量的影响

2.2 敲低Catsup对果蝇卵巢niche的影响

生殖干细胞存在于niche组织中,对果蝇卵子形成至关重要[22]。在niche组织中,Catsup表达下调对卵巢niche及其大小的影响如图2所示。

图2 Catsup表达下调对卵巢niche及其大小的影响

从图2可以看出,CatsupRNAi会导致果蝇卵巢niche丢失(图2a中红色箭头所指),同时Catsup表达下调也会导致卵巢大小显著减小(图2b,P<0.01),结果表明Catsup表达下调影响果蝇卵巢niche结构维持,进而导致果蝇产蛋减少。

2.3 膳食加锌对生殖障碍的影响

Catsup蛋白负责将高尔基体内锌转运至细胞质内[11],CatsupRNAi会导致高尔基体内积锌,细胞质内缺锌。本文通过调控膳食中锌水平分析Catsup敲低对生殖的影响,如图3所示。

图3中:A代表正常食物(normal food,NF)W1118;B代表4 mmol/L ZnCl2W1118;C代表50 μmol/L TPEN W1118;D代表正常食物 NFCatsupRNAi;E代表4 mmol/L ZnCl2CatsupRNAi;F代表50 μmol/L TPENCatsupRNAi。从图3可以看出,在膳食中添加4 mmol/L ZnCl2能够在一定程度挽救Catsup敲低导致果蝇产蛋下降,并且其卵巢niche结构和卵巢大小都明显恢复;而膳食中添加锌螯合剂50 μmol/L TPEN则会加重这些表型。结果表明Catsup敲低导致细胞质锌减少,从而引起果蝇生殖障碍问题,可通过膳食补锌改善由于细胞质缺锌导致的生殖障碍问题。

2.4 遗传补锌对生殖障碍的影响

为了进一步证实Catsup敲低导致的生殖问题与细胞质内缺锌相关,本实验利用遗传手段调控细胞内锌水平观察Catsup敲低对生殖的影响。dZnt7蛋白定位于高尔基体上,负责将其转运到细胞质中,与Catsup功能相反;dZip1蛋白定位于细胞膜上,负责将胞外锌转运至胞内,dZnt1蛋白定位于细胞膜,负责将胞质中的锌转出细胞,与dZip1蛋白功能相反[11]。通过遗传重组技术共表达锌转运相关蛋白,观察对果蝇产蛋能力、niche结构和卵巢大小的影响,如图4所示。

图4 遗传手段改变细胞质锌水平对生殖的影响

图4中:a代表W1118;b代表CatsupRNAi;c代表CatsupRNAi;dZnt7 RNAi;d代表CatsupRNAi;dZip1 OE;e代表CatsupRNAi;dZnt1 OE。从图4可以看出,dZnt7 RNAi可以完全挽救CatsupRNAi导致的产蛋能力减弱、niche丢失和卵巢变小等问题;dZip1 OE可以部分挽救CatsupRNAi导致的生殖问题;而dZnt1 OE则会加重表型。结果表明,Catsup敲低导致细胞质缺锌,高尔基体内积锌,而dZnt7 RNAi或dZip1 OE能够提高细胞质锌水平,挽救生殖缺陷问题,此外,dZnt1 OE降低细胞质内锌水平会加重表型。因此,敲低Catsup是通过影响细胞内锌水平导致果蝇的生殖障碍问题。

2.5 敲低Catsup对卵巢卵原区胶原蛋白的影响

已有研究发现胶原蛋白对生殖有重要作用,在果蝇卵巢niche中,Ⅳ型胶原蛋白和β-整合素共同作用维持E-Cadherin正常水平,从而确保生殖干细胞在卵巢粘附,维持卵巢niche结构[23]。因此,本文推测Catsup敲低可能影响了卵巢中胶原蛋白的水平,进而影响卵巢niche结构维持。本实验利用C587-Gal4、Vkg-GFP来观察niche部位胶原蛋白水平,Catsup表达下调对卵巢卵原区胶原蛋白的影响如图5所示。

图5 Catsup表达下调对卵巢卵原区胶原蛋白的影响

从图5可以看出,Catsup敲低导致卵巢卵原区胶原蛋白显著减少;dZnt7 RNAi可以完全挽救Catsup敲低导致的胶原蛋白降低;dZip1 OE可以部分挽救;而dZnt1 OE则会加重该表型。结果表明Catsup敲低导致卵原区胶原蛋白减少,影响卵巢niche结构维持,导致卵巢缺陷、产蛋能力下降。

3 讨 论

本研究发现,在卵巢中敲低Catsup会导致产蛋显著减少、卵巢niche丢失和卵巢变小等生殖障碍问题,这些生殖缺陷可能与敲低Catsup导致细胞质缺锌相关。从膳食角度出发,调控细胞内锌水平发现，膳食补锌能够在一定程度上挽救敲低Catsup导致的果蝇生殖障碍问题,其对产蛋能力、卵巢niche结构和卵原区胶原蛋白水平都有一定程度的挽救。

利用遗传手段在卵巢niche部位敲低Znt7或过表达Zip1,增加细胞质内锌水平,能够很好地挽救CatsupRNAi导致的生殖缺陷。结果表明,Catsup在卵巢表达减少,引起细胞质锌缺乏,导致卵原区胶原蛋白表达减少,影响卵巢niche结构维持、卵巢形态异常和产蛋能力减弱。

许多文献报道,锌对生殖健康具有重要作用,但是目前分子机制并不清楚。Catsup基因是哺乳动物Zip7基因的同源物,具有调控细胞内锌稳态作用。本研究发现Catsup基因通过调控细胞内锌水平影响生殖发育,该结果为机体锌缺乏导致的生殖问题的诊断和治疗提供理论依据,也为生殖健康相关保健食品的开发奠定一定基础。