miR-3074通过靶向EPS8基因对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响

罗全慧 尹 恒 黄 柯 王锦星 赵 琳

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病因素包括基因突变、病毒感染等[1]。宫颈癌发生率和病死率均较高，尤其宫颈癌中晚期和复发患者的预后很差，与宫颈癌细胞的恶性增殖和侵袭关系密切[2]。因此，探究宫颈癌细胞增殖和侵袭的分子机制对宫颈癌临床治疗有重要意义。微小RNA(microRNA, miRNA)主要在基因的转录水平参与调控靶基因的表达，其表达失衡可引起靶基因的转录改变，影响细胞分化、代谢、发育、增殖、侵袭等各种细胞活动[3]。miRNA是介导恶性肿瘤包括宫颈癌发生和发展的重要因素，以miRNA为靶点的新型治疗策略是宫颈癌临床治疗研究的热点[4, 5]。miR-3074是新明确的miRNA家族成员，已被证实参与三阴性乳腺癌的进展，在其中发挥抑癌基因的作用[6]。miR-3074对宫颈癌细胞生物学行为的影响并不清楚。本研究旨在分析miR-3074在宫颈癌细胞系中的表达水平，探讨miR-3074对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响及其分子作用机制，为宫颈癌的miRNA靶向治疗提供相应的实验基础。

材料与方法

1.细胞与试剂：正常宫颈上皮细胞H8、宫颈癌细胞(SiHa、HCC94、C33A、HeLa)购自美国典型培养物菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司。Matrigel基质胶购自美国BD公司。荧光实时定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)相关试剂盒购自日本TaKaRa公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。DMEM/F12培养基、胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Amresco公司。Transwell小室购自美国Corning公司。对照模拟物、miR-3074模拟物、EPS8mRNA野生型载体、EPS8mRNA突变型载体、si-NC和si-EPS8购自上海吉玛生物制药技术有限公司。CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司。一抗皮生长因子受体通路底物8(epidermal growth factor receptor substrate 8，EPS8)、β-tubulin、Claudin-1、ZO-1和Twist及二抗均购自美国CST公司。

2.生物信息学分析miR-3074表达与宫颈癌患者总生存期的相关性：应用OncoLnc在线数据库分析miR-3074表达水平与宫颈癌患者总生存期的关系。

3.细胞培养及分组：常规复苏C33A、H8细胞，采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，常规复苏SiHa、HCC94、HeLa细胞，采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，在37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。收集对数生长期HCC94细胞接种至6孔板，依据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，分别转染对照模拟物和miR-3074模拟物至HCC94细胞，即对照组和miR-3074组；分别转染si-NC和si-EPS8至HCC94细胞，即si-NC组和si-EPS8组。转染结束后进行后续实验。

4.RT-qPCR检测：按照TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，进一步反转录合成cDNA，行RT-qPCR检测。反应体系为30μl，反应参数为95℃预变性4min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共33次循环。引物序列如下，miR-3074上游引物：5′-CCTCAAGGCTGTGTTGTCAAG-3′，下游引物：5′-ATACCACTGCTGTTGGGTCTG-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；EPS8上游引物：5′-TGAATGGCTACGGATCATCACC-3′，下游引物：5′-CACTGTCCCGTGCATAATTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以U6为内参，确定miR-3074相对表达量；以GAPDH为内参，确定EPS8mRNA相对表达量，采用2-ΔΔCt公式计算miR-3074和EPS8mRNA的相对表达量。

5.双荧光素酶报告基因实验：运用生物信息学软件RNAhybrid预测miR-3074的靶基因为EPS8。收集对数生长期的HCC94细胞，将EPS8mRNA野生型载体、EPS8mRNA突变型载体与对照模拟物或miR-3074模拟物共转染至HCC94细胞，依照Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染。在37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养48h，以海肾荧光素酶活性为内参，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定相对荧光素酶活性。

6.Western blot法实验：收集转染的HCC94细胞，提取总蛋白后测定蛋白浓度，每组取适量蛋白行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶电泳，采用聚偏氟乙烯膜转膜，于4%封闭液中进行封闭。依次加入一抗EPS8(1∶1000稀释)、β-tubulin(1∶1000稀释)、Claudin-1(1∶1000稀释)、ZO-1(1∶1000)、Twist(1∶1000)，4℃下孵育8h。加入二抗(1∶5000)孵育。采用电化学发光法检测每组蛋白表达，在凝胶成像系统中显色、拍照。

7.CCK-8法检测HCC94细胞增殖活力：收集转染的HCC94细胞，以3×103个/孔细胞接种至96孔板，分别于培养第1、2、3、4、5天时，每孔加入浓度为6mg/ml的CCK-8溶液10μl，在37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养4h，运用全自动酶标仪测定450nm波长处每孔的吸光度A值，绘制HCC94细胞生长曲线。

8.Transwell实验检测HCC94细胞侵袭能力：在冰上采用培养基稀释Matrigel胶，均匀滴加至Transwell小室，消除气泡，培养箱内静置1h。收集转染的HCC94细胞，采用不含血清的培养基重悬，以3×104个/孔细胞接种至Transwell小室上室，加入含10%胎牛血清的培养基至下室。在37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24h，用甲醇固定上室，用0.2%结晶紫染色上室，棉签擦去未侵袭的细胞，于100倍倒置显微镜下拍照观察，计数发生侵袭的细胞数。

结 果

1.miR-3074与宫颈癌患者总生存期的关系：OncoLnc在线数据库显示(图1)，miR-3074表达水平较高的宫颈癌患者总生存期长于miR-3074表达水平较低的患者，差异有统计学意义(P<0.001)。

图1 miR-3074与宫颈癌患者总生存期的关系

2.miR-3074在宫颈癌细胞系中低表达： RT-qPCR检测结果显示，miR-3074在宫颈癌细胞(SiHa、HCC94、C33A、HeLa)及正常宫颈上皮细胞H8的表达分别为0.70±0.02、0.23±0.03、0.48±0.06、0.59±0.07和1.06±0.12。与H8细胞比较，宫颈癌细胞系中miR-3074表达降低(t=2.925，P=0.027；t=6.930，P<0.001；t=4.404，P=0.005；t=3.379，P=0.015)，其中miR-3074表达最低的细胞系是HCC94(F=13.400，P<0.001，图2)。

图2 miR-3074在宫颈癌细胞系(SiHa、HCC94、C33A、HeLa)和正常宫颈上皮细胞(H8)中的表达与H8细胞比较，*P<0.05，**P<0.01

3.转染miR-3074模拟物促进HCC94细胞中miR-3074表达：miR-3074组和对照组HCC94细胞中miR-3074表达分别为13.49±2.66和1.03±0.17，差异有统计学意义(t=4.680，P=0.003)。

4.生物信息学软件预测miR-3074的靶基因：生物信息学软件RNAhybrid预测显示，miR-3074与EPS8 3′非翻译区存在结合位点，结合位点和突变位点详见图3。

图3 生物信息学软件预测miR-3074的靶基因

5.双荧光素酶报告基因实验验证miR-3074对EPS8的靶向作用：双荧光素酶报告基因实验结果显示，对照模拟物、EPS8mRNA野生型共转染组与miR-3074模拟物、EPS8mRNA野生型共转染组相对荧光酶活性分别是1.03±0.09和0.26±0.05，差异有统计学意义(t=7.336，P<0.001)；对照模拟物、EPS8mRNA突变型共转染组与miR-3074模拟物、EPS8mRNA突变型共转染组相对荧光酶活性分别是1.08±0.13和1.01±0.07，差异有统计学意义(t=0.407，P=0.698)，提示miR-3074可靶向结合EPS8 mRNA(图4)。

图4 双荧光素酶报告基因实验验证miR-3074对EPS8的靶向作用

6.上调miR-3074对EPS8mRNA表达的影响：RT-qPCR检测结果显示，与H8细胞比较，宫颈癌细胞系中EPS8mRNA表达显著增加(P<0.001)，其中miR-3074表达最低的细胞系是HCC94(F=39.970，P<0.001)。miR-3074组和对照组HCC94细胞中EPS8mRNA表达分别为1.23±0.12和6.83±0.91，差异有统计学意义(t=4.583，P=0.004)，表明高表达miR-3074可靶向抑制EPS8mRNA的表达(图5)。

图5 EPS8mRNA在宫颈癌细胞系(SiHa、HCC94、C33A、HeLa)和正常宫颈上皮细胞(H8)中的表达与H8细胞比较，*P<0.01

7.上调miR-3074对EPS8蛋白表达的影响：Western blot法检测结果显示，转染miR-3074模拟物后，EPS8蛋白表达降低，上皮细胞表型蛋白ZO-1和Claudin-1表达增加，间质细胞表型蛋白Twist表达降低(图6)。

图6 高表达miR-3074对HCC94细胞EPS8蛋白表达的影响

8.干扰EPS8对HCC94细胞增殖活力的影响：CCK-8法检测结果显示，在第2、3、4、5天，si-EPS8组HCC94细胞D值低于si-NC组(P<0.05)，表明干扰EPS8可抑制HCC94细胞的增殖活力(表1)。

表1 CCK-8法检测干扰EPS8对HCC94细胞增殖活力的影响

9.干扰EPS8对HCC94细胞侵袭能力的影响：Transwell实验检测结果显示，si-EPS8组和si-NC组HCC94细胞的穿胶细胞数分别为46.42±12.74个和99.09±20.26个，差异有统计学意义(t=4.403，P=0.005)，表明干扰EPS8可抑制HCC94细胞的侵袭能力(图7)。

图7 干扰EPS8对HCC94细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×100)A.Transwell实验定量结果；B.Transwell实验穿胶细胞;与si-NC组比较，*P<0.01

10.上调miR-3074对HCC94细胞增殖活力的影响：CCK-8法检测结果显示，在第2、3、4、5天，miR-3074组HCC94细胞A值明显低于对照组(P<0.05)，提示miR-3074可抑制HCC94细胞的增殖活力(表2)。

表2 CCK-8检测miR-3074对HCC94细胞增殖活力的影响

11.上调miR-3074对HCC94细胞侵袭能力的影响：Transwell实验检测结果显示，miR-3074组和对照组HCC94细胞的穿胶细胞数分别为68.91±9.45个和135.10±14.75个，差异有统计学意义(t=3.777，P=0.009)，表明miR-3074可抑制HCC94细胞的侵袭能力(图8)。

图8 miR-3074对HCC94细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×100)A.Transwell实验定量结果；B.Transwell实验穿胶细胞

讨 论

miRNA是一种非编码的内源性单链RNA，随着分子生物学的发展，miRNA被证实广泛参与细胞的生理和病理过程[7]。既往研究证实，miRNA在包括宫颈癌在内的恶性肿瘤组织和细胞中异常表达，已成为重要的分子诊断标志物和治疗靶点[8, 9]。miRNA如miR-96、miR-106b、miR-873、miR-612、miR-4429被证实在宫颈癌组织中异常表达，发挥促癌或抑癌的效应[10～14]。Lou等[6]研究表明，miR-3074能够诱导三阴性乳腺癌细胞周期停滞、细胞凋亡和细胞自噬，抑制三阴性乳腺癌的进展，提示miR-3074在三阴性乳腺癌中发挥抑癌作用。OncoLnc在线数据库显示，miR-3074表达水平较高的宫颈癌患者生存期长于miR-3074表达水平较低的患者，miR-3074高表达与患者生存期存在相关性。本研究发现，miR-3074在宫颈癌细胞系中的表达低于正常宫颈上皮细胞，过表达miR-3074可有效抑制宫颈癌HCC94细胞的增殖活力和侵袭能力，提示miR-3074在宫颈癌细胞中发挥抑癌作用。

miRNA通过互补配对结合下游靶基因mRNA 3′非翻译区，在转录水平导致靶基因mRNA的分解或者翻译沉默，从而下调靶基因在细胞中的表达[15]。本研究通过生物信息学软件RNAhybrid预测显示，miR-3074与EPS8mRNA 3′非翻译区存在结合位点。EPS8蛋白广泛存在于上皮细胞和间质细胞，参与调控细胞有丝分裂、增殖、分化等过程，是表皮生长因子受体蛋白的重要底物[16]。近年来研究表明，多种恶性肿瘤组织中均发现EPS8的高表达，其与肿瘤的高度增殖、远处转移和血管生成显著相关，是一种重要的促癌蛋白[17, 18]。研究证实，EPS8蛋白在宫颈癌组织中高表达，其高表达与宫颈癌细胞的化疗敏感度和患者生存期呈负相关，EPS8蛋白可显著促进宫颈癌细胞的增殖、转移和上皮间质转化[19, 20]。

本研究发现，干扰EPS8可有效抑制HCC94细胞的增殖活力和侵袭能力。本研究进一步研究显示，转染miR-3074模拟物可使宫颈癌HCC94细胞中EPS8表达被抑制。利用双荧光素酶报告基因实验验证，miR-3074通过作用于EPS8 mRNA 3′非翻译区，实现对EPS8的靶向调控作用。随着EPS8基因表达下降，上皮细胞表型蛋白ZO-1和Claudin-1表达增加，间质细胞表型蛋白Twist表达减少，提示HCC94细胞的上皮间质转化过程受到抑制。以上结果证实，miR-3074通过靶向下调EPS8表达在HCC94细胞中发挥抑癌作用。

综上所述，miR-3074在宫颈癌细胞系中表达下调，过表达miR-3074可有效抑制宫颈癌HCC94细胞的增殖及侵袭，其分子机制可能与靶向调控EPS8基因表达有关。