道地药材月见草总多酚的提取工艺研究

牛佳雯，雒江菡，张雨欣，李 婧，禚 昊

(哈尔滨商业大学细胞与分子生物学研究所，黑龙江哈尔滨 150076)

月见草(OenotherabiennisL.)为柳叶菜科月见草属下的一个种，是黑龙江省大庆市大同区典型的道地药材，大同区自然环境、土壤优势非常适宜月见草生长，药材品质好、有效成分含量高[1]，月见草被誉为“皇室御药”，可治疗多种疾病，在调节血液中类脂物质，对高胆固醇、高血脂引起的冠状动脉栓塞、粥样硬化及脑血栓等症有显著疗效，是最有开发前景的物种之一[2-4]。目前国内月见草种植已形成规模，其生态价值、药用和保健价值已被人们逐渐所认识。目前，从月见草的叶、根、茎、种子中已分离得到多种类型的化合物，主要为黄酮类化合物、萜类化合物、挥发油、鞣质和多酚等[5]。对于这些成分的提取也有相对较成熟的工艺方法，但是对于月见草多酚提取的研究相对较少。多酚类物质具有很强的抗菌、抗氧化活性，能够预防糖尿病和心血管疾病、抑制癌细胞增殖等生理功能[6-9]。该研究采用单因素试验考察浸提温度、提取时间、料液比和乙醇浓度对总多酚提取量的影响，采用正交试验优化月见草总多酚的提取工艺，以期为今后月见草的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试材。月见草，黑龙江省大庆市大同区典型的道地药材。没食子酸标准品(纯度≥98%)，250 mg/瓶，北京万佳标准物质研发中心；福林酚试剂，100 mL/瓶，北京万佳标准物质研发中心；无水乙醇，500 mL/瓶，天津市天力化学试剂有限公司；无水碳酸钠，500 g/瓶，天津市致远化学试剂有限公司。

1.1.2仪器。高速多功能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；电子分析天平，赛多利斯(上海)贸易有限公司；数显恒温水浴锅，常州市恒久仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1没食子酸标准曲线的绘制。称取没食子酸标准品0.025 g，加入蒸馏水溶解，用500 mL容量瓶定容，得质量浓度0.05 mg/mL没食子酸标准溶液。准确量取0、0.10、0.20、0.30、0.50、0.80、1.00 mL的没食子酸标准溶液，将标准液分别放在50 mL棕色容量瓶中，加入4 mL福林酚试剂，摇匀，加入4 mL的10%Na2CO3溶液，充分混匀后定容，室温静置反应1 h，于765 nm波长处测吸光度，不加没食子酸标准溶液为空白对照组。以标准液没食子酸的质量浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线[10]。月见草总多酚提取量(mg/g)=标准曲线计算的总多酚浓度×提取液定容的体积/月见草药材质量。

1.2.2单因素试验。

1.2.2.1浸提温度对月见草总多酚提取量的影响。精密称定5份1.0 g月见草粉末，置100 mL圆底烧瓶中，加70%乙醇30 mL，在50、60、70、80、90 ℃水浴锅提取3 h，抽滤，加入适量蒸馏水定容至50 mL。从5支具塞试管中精密吸取5 mL滤液，分别置25 mL具塞试管中，编号1～5，加70%乙醇稀释并定容至刻度，摇匀。再从这5 支试管中分别取出溶液适量放于比色皿中，空白对照选用70%乙醇，在765 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算月见草总多酚提取量，考察浸提温度对月见草总多酚提取量的影响。

1.2.2.2乙醇浓度对月见草总多酚提取量的影响。精密称定5份1.0 g月见草粉末，置100 mL圆底烧瓶中，加30 mL 60%、70%、80%、90%、100%乙醇，70 ℃水浴锅提取3 h，抽滤，加适量蒸馏水定容至50 mL。从5支具塞试管中精密吸取滤液5 mL，分别置25 mL具塞试管中，编号16～20，加相应乙醇稀释并定容至刻度，且摇匀。再从这5支试管中分别取出溶液适量放于比色皿中，空白对照选用相应浓度的乙醇，在765 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算月见草总多酚的提取量，考察乙醇浓度对月见草总多酚提取量的影响。

1.2.2.3料液比对月见草总多酚提取量的影响。精密称定5份1.0 g月见草粉末，置100 mL圆底烧瓶，加10、20、30、40、50 mL 70%乙醇，70 ℃水浴锅提取3 h，抽滤，加蒸馏水，并定容至50 mL。从5 支具塞试管中精密吸取滤液5 mL，分别置25 mL具塞试管中，编号11～15，向各试管中加80%乙醇稀释并定容至刻度，且摇匀。再从这5 支试管中分别取出溶液适量于比色皿中，空白对照选用70%乙醇，在765 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算月见草总多酚提取量，考察料液比对月见草总多酚提取量的影响。

1.2.2.4提取时间对月见草总多酚提取量的影响。精密称定5份1.0 g月见草粉末，置100 mL圆底烧瓶，加70%乙醇30 mL，70 ℃水浴锅提取1、2、3、4、5 h，抽滤，向抽滤液中加入适量蒸馏水，并定容至50 mL。从5支具塞试管中精密吸取滤液5 mL，分别置25 mL具塞试管中，编号6～10，加70%乙醇稀释并定容至刻度，并摇匀。再从这5支试管中分别取出适量的溶液放于比色皿，空白对照选用70%乙醇，在765 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算月见草总多酚提取量，考察提取时间对月见草总多酚提取量的影响。

1.2.3正交试验设计。在单因素试验基础上，选取浸提温度、提取时间、料液比、乙醇浓度4个变量为参考因素，选出对试验影响较大的3个水平，进行4因素3水平正交试验设计，正交试验因素水平见表1。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的绘制根据“1.2.1”中的线性关系考察配制溶液后，采用紫外分光光度法于765 nm波长处测定吸光度。以标准液没食子酸的质量浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图1)，得出回归方程为y=7.009 7x+0.004 8(R2=0.999 3)。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 单因素试验

2.2.1浸提温度对月见草总多酚提取量的影响。从图2可以看出，随着浸提温度的升高，总多酚提取量呈现出先升高后逐渐降低的趋势。在浸提温度为80 ℃时，月见草总多酚提取量达到最大值。这是由于随着浸提温度的提高，乙醇分子作为溶剂，运动速度加快，与月见草接触充分，加大月见草总多酚溶出量，但当温度超过80 ℃以后，高温使提取物总多酚发生氧化，从而使月见草总多酚提取量降低，因此，提取的最佳浸提温度为80 ℃。

图2 浸提温度对月见草总多酚提取量的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on total polyphenol extraction amount of Oenothera biennis

2.2.2乙醇浓度对月见草总多酚提取量的影响。从图3可以看出，随着乙醇浓度的提高，月见草总多酚提取量呈现出先升高后平稳的趋势。当乙醇浓度由60%增加至70%时，总多酚提取量明显提高，但当乙醇浓度超过70%以后，随着乙醇浓度的增加，提取量变化不大。主要是因为溶剂浓度越高，溶剂传质推动力越大，浸提效果越好；但使用过多的提取剂，会导致后续提取剂的回收成本及耗能增加，使经济效益下降，污染物的排放也会增加，所以，应该选择合适的提取剂浓度。根据以上分析，确定提取的最佳乙醇浓度为70%。

图3 乙醇浓度对月见草总多酚提取量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on total polyphenol extraction amount of Oenothera biennis

2.2.3料液比对月见草总多酚提取量的影响。从图4可以看出，随着料液比的降低，月见草总多酚提取量呈现出先升高后平稳的趋势。料液比为1∶30时，总多酚提取量最大，超过1∶30以后总多酚提取量趋于稳定。这主要是由于1∶30 的料液比就能较充分地提取月见草中的多酚类物质，即使溶剂量增加，总多酚提取量未见明显提高，反倒给后续的活性物质分离纯化及溶剂回收带来麻烦，成本增加。因此，确定提取的最佳料液比为1∶30。

图4 料液比对月见草总多酚提取量的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on total polyphenol extraction amount of Oenothera biennis

2.2.4提取时间对月见草总多酚提取量的影响。从图5可以看出，随着提取时间的延长，月见草总多酚提取量呈现出先升高而后逐渐降低的趋势。当提取时间为4 h时，总多酚提取量最大，之后由于提取时间的延长，浸提液中多酚类物质长时间与空气接触，发生氧化作用，从而导致总多酚提取量降低，但提取时间由3 h 延长至4 h以后，总多酚提取量增加并不明显。考虑到节能原因，并结合以上分析，确定提取的最佳提取时间为4 h。

图5 提取时间对月见草总多酚提取量的影响Fig.5 Effect of extraction time on total polyphenol extraction amount of Oenothera biennis

2.3 正交试验为了进一步优化提取工艺条件，在单因素试验基础上进行L9(34)正交试验(表1)。正交试验结果与分析如表2所示。从表2可以看出，各因素对月见草总多酚提取量的影响从大到小依次为A>B>D>C，即浸提温度的影响最大，其次是乙醇浓度、提取时间，料液比的影响最小。方差分析结果表明，浸提温度对总多酚提取效果影响显著，而料液比对多酚提取效果影响并不明显。试验得出月见草总多酚的最佳提取工艺为A3B2C2D2，即浸提温度80 ℃、乙醇浓度70%、料液比1∶30、提取时间3 h，此时，吸光度为0.632，总多酚提取量为4.47 mg/g。

2.4 方法学考察

2.4.1精密度试验。用移液管吸取1.0 mL没食子酸配制的对照品溶液，置于25 mL具塞试管中，向其中加入95%乙醇溶液定容至刻度并振荡摇匀，用紫外分光光度计在765 nm处重复测定吸光度6次，计算得出其RSD为0.13%，表明精密度良好。

表1 正交试验因素和水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

表2 正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

2.4.2稳定性试验。移液管取同一供试品溶液1.0 mL，置于25 mL具塞试管中，加100%乙醇定容。分别经过0、1、2、3、4、5 h后，采用紫外分光光度计在765 nm处分别测定吸光度，每次测定需重复操作3次，计算得出其RSD为0.98%，表明样品溶液在5 h内检测稳定。

2.4.3重复性试验。取同一批1.0 mL月见草总多酚提取液5份，按“1.2.1”方法制备供试品溶液，765 nm处测定吸光度，计算吸光度平均值为0.630，总多酚提取量为4.46 mg/g，表明该试验重复性良好。

3 结论

该研究通过单因素试验和正交试验确定了月见草总多酚提取的最佳工艺：浸提温度80 ℃、乙醇浓度70%、料液比1∶30、提取时间3 h，此时，吸光度为0.632，总多酚提取量为4.47 mg/g；通过精密度试验、稳定性试验、重复性试验3种方法学考察，验证了该试验的重复性良好，该试验结果可为植物中多酚类化合物的提取奠定一定的理论基础。