聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl在多糖分离纯化中的应用进展*

王 雨，孙延平，乔威杰，杨炳友，匡海学

（黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

多糖广泛存在于生物体中，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降血糖及免疫调节等多种药理活性[1]。多个研究结果表明，多糖分子量与其生物活性密切相关[2]。迄今针对不同分子量段多糖的常用分离纯化方法主要有分级醇沉法、超滤分离法和凝胶柱层析法。其中凝胶柱层析法是通用的分离纯化多糖方法之一，具有分子筛的性质，多应用于多糖的精细分离[3]。常用的固定相凝胶填料主要有Sephadex葡聚糖凝胶、Sepharose琼脂糖凝胶和Sephacryl系列聚丙烯酰胺凝胶[4]。与前两种凝胶稍有不同，Sephacryl系列凝胶可选的型号类型较多，可根据不同多糖样品的分子量大小分布特点，达到最佳分离效果，同时还具有分离范围广，化学稳定性高，机械性能好等优点[5]。然而，目前针对聚丙烯酰胺凝胶（Sephacryl）在多糖的分离纯化中应用方面的系统综述较少。因此，本文选取Sephacryl凝胶作为研究对象，对其性质特点、使用方法及系列柱层析在活性多糖分离纯化中的应用情况进行概述，为多糖研究工作者提供参考。

1 Sephacryl凝胶性质特点

聚丙烯酰胺凝胶（Sephacryl）是一种烯丙基葡聚糖和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物，属于通用型凝胶过滤介质，粒径大小范围为25～75μm。凝胶填料pH值保持在3～11范围内，适合于长时间放置；pH值保持在2～13范围内，适合于短期内再生、原地清洗等过程，其化学稳定性高于其他传统凝胶。可在121°C，pH值为7，30min的条件下进行高压灭菌。其亲水刚性基质可最大限度地减少非特异性吸附，提高回收率，同时增加了基体的刚性，确保快速流动特性和高分辨率。

2 Sephacryl凝胶使用方法

2.1 填料装柱前处理及装柱

将储存于20%乙醇溶液中的Sephacryl凝胶放入去离子水内，重复洗涤3次，浸泡过夜。装柱后使凝胶在柱内自由沉降，平衡液上柱前，须进行脱气处理。可用蠕动泵加压让流速维持稳定，但需注意压力不要超过填料最大耐压。一般平衡层析柱至少5～10个柱体积后再进行上样。

2.2 样品前处理及填料储存

多糖样品溶液用平衡液进行配制，所有样品溶液及平衡溶液在上柱使用前应离心或过滤（0.45μm），上样量不超过柱体积的5%。新购置的Sephacryl凝胶密封储存在4～25℃的20%乙醇保存溶液中，所处环境保持通风、干燥、清洁，不能冷冻。用过的凝胶填料储存在4℃的20%乙醇保存溶液中，保质期一般不超过2年。

3 Sephacryl凝胶在活性多糖分离纯化中的应用

根据不同分离范围Sephacryl凝胶可分为S-100～500系列，结合具体在活性多糖分离纯化中的应用实例（见表1），除了多糖还适用于肽类、激素类、蛋白、DNA片段等样品的分离。

3.1 免疫活性多糖的分离

免疫失调是在一部分诱因，如过度饮酒，过敏源等刺激影响下，引发许多基因、蛋白质以及细胞的作用，会导致包括免疫系统受损及变态反应等在内的大量相关疾病的发生。随着愈来愈多的多糖被发现显示出免疫调节活性，其免疫作用机理、功效因子也越加清楚和确切[16]。Shi等[8]采用阴离子交换柱层析法和凝胶过滤柱层析法对石耳样品进行纯化，用超纯水作为流动相通过DEAE-Cellulose色谱柱得到洗脱组分UP1，UP1再经Sephacryl S-200柱（1.0cm×80cm）进一步分离纯化，以0.2mL·min-1为流速继续采用超纯水洗脱，得到分子量为2.81×105Da的高纯度多糖UP1-1。药理结果表明，UP1-1能呈剂量依赖性地促进RAW 264.7细胞的吞噬活性和NO的产生，具有良好的免疫刺激活性。Zhang等[10]将红参粗多糖样品装入DEAE-52层析柱，用蒸馏水洗脱，得到RGRP-1洗脱组分，采用Sephacryl S-300 HR色谱柱（80cm×1.5cm）进一步纯化RGRP-1，得到平均分子量分别为2.13×104Da和1.02×104Da的均一多糖RGRP-1a和RGRP-1b，药理结果表明，RGRP-1b具有明显的生物学活性，可通过巨噬细胞活化促进巨噬细胞产生NO、TNF-α、IL-6和IL-12，促进HuH7细胞凋亡，具有很强的免疫调节活性。Zhang等[15]采用水提梯度醇沉的方法从正红菇子实体中提取分离得到3种主要沉淀。使用Sephacryl S-500 HR色谱柱，在A KTA纯化系统上进一步纯化这些乙醇沉淀物以除去共沉淀物，不同组分样品以2mg·mL-1的浓度进入色谱柱。用PBS缓冲液（pH值7.4，50 mmol·L-1）洗脱，流速为1.3mL·min-1，最终得到Mw分别为2.18×106、3.92×105、9.36×104Da的纯化组分，药理结果表明，其中纯化组分WRP-1具有较强的免疫刺激作用。

表1 常用Sephacryl凝胶类型、分离范围及在活性多糖分离应用中的实例Tab.1 Type and separation range of commonly used Sephacryl gel and its application in the isolation of active polysaccharides

3.2 抗氧化活性多糖的分离

过多的自由基会引起衰老、肿瘤以及其它各类疾病的产生，近20年发现天然来源的多糖具有显著抗氧化活性，深受学者追捧[17]。Cheng等[6]以落叶松木屑粗多糖AGD水溶液经Sephacryl S-100 HR凝胶柱（1.6cm×60cm）进行纯化，流动相为0.05mol·L-1PBS缓冲液（含0.15mol·L-1NaCl，pH值7.0），流速为0.5mL·min-1，分离得到了分子量为3.7×103Da的AGD2。实验显示，AGD2具有羟自由基清除活性，此外，AGD2能更好地促进促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌。Wu等[9]用DEAE Sephose FF色谱柱分离得到的超纯水洗脱组分浙江金线兰多糖AZP-1，再经Sephacryl S-200 HR凝胶渗透柱（2.6cm×95cm）进一步纯化。用去离子水以0.3mL·2min-1的流速洗脱，得到Mw分别为3.41×104Da和4.568×10-3Da的浙江金线兰均一多糖AZP-1a和AZP-1d，药理实验表明，这两种多糖均对CCl4诱导的肝细胞氧化损伤有保护作用。Teng等[11]经DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱洗脱得到藜麦多糖样品QAP，根据分子量的差异，用Sephacryl S-300 HR色谱柱（2.6cm×100cm）进一步纯化，分离得到两种多糖SQAP-1和SQAP-2，其中SQAP-2抗氧化活性显著高于SQAP-1。Sun等[1]从骆驼刺内生细菌NX-11中提取粗多糖，用DEAE纤维素分离得到两个NaCl溶液洗脱组分，在Sephacryl S-500 HR色谱柱（16mm×40cm）上进一步纯化，以超纯水为洗脱剂，流速为0.2mL·min-1，分别得到平均分子量为1.326×106Da和1.959×106Da的PAPS1和PAPS2，药理活性表明，均具有较强的抗氧化能力。

3.3 抗骨质疏松活性多糖的分离

骨质疏松症是最普遍的一种全身性代谢性骨病，其特点是骨量和骨质量的衰退，因骨质疏松引发的脆性骨折发病率和死亡率逐年增加[18]。迄今已有大量研究表明，一些多糖可通过平衡骨吸收和骨形成而发挥抗骨质疏松作用。Zheng等[13]将淫羊藿粗多糖样品溶液置于DEAE-52纤维素柱，得到蒸馏水洗脱组分CEBP1。CEBP1再经Sephacryl S-400凝胶柱（2.5cm×100cm）用0.1M NaCl以0.5mL·min-1的流速洗脱，得到分子量约为2×104Da的均一多糖EBP，体外药理实验表明，EBP呈现对糖皮质激素性骨质疏松症的体外保护作用。Ye等[7]将骆驼刺粗多糖水溶液装入DEAE-52纤维素柱，得到0.05M NaCl洗脱组分，再装入Sephacryl S-100柱（1.6cm×100cm）重复分离洗脱，得到分子量为5.9×103Da的纯化均一多糖APP90-2，药理实验结果表明，APP90-2可显著促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化，表明APP90-2具有明显的成骨活性。

3.4 调节肠道微生物活性多糖的分离

人体肠道内存在着数量巨大、种类千差万别的微生物，称之为肠道菌群。肠道菌群失调，可触发和加重各类疾病的发生。多糖中无法被立刻分解的成分与发酵所产生的短链脂肪酸，继而调节肠道菌群的组成，改进肠道生理功能，调控抗肿瘤、抗炎、抗病原微生物等基因表达，从而实现疾病治疗目标[19]。Cui等[12]用Sepharose 6B柱分离得到褐藻马尾藻海带多糖组分，经Sephacryl S-300 HR柱（2.2cm×100cm）进一步纯化，得到分子量为8.4×103Da的均一多糖SHNP，体外发酵实验结果表明，肠道中短链脂肪酸总量、乙酸、丙酸和正丁酸显著增加。此外，SHNP刺激肠杆菌科细菌的生长，同时消耗副流感嗜血杆菌和福尔米格芽孢杆菌。这些结果表明，SHNP具有潜在参与调节肠道微生物的作用。

3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性多糖的分离

通过抑制α-葡萄糖苷酶，减缓淀粉分解的速率，降低和推迟小肠对葡萄糖的吸收，从而降低血糖。目前，相当多一部分多糖也显示出相关的α-葡萄糖苷酶抑制活性，对于糖尿病糖代谢、病理的改善以及对α-糖苷酶的抑制中发挥了多种生理作用[20]。Lv等[14]从麦麸中分级醇沉得到两个粗多糖级分装入DEAE Cellulose-52阴离子交换柱，用0.1M NaCl溶液洗脱得到的两个主要组分（W2和A2），再分别用Sephacryl S-400凝胶渗透色谱柱进一步纯化，以0.2mL·min-1流速得到分子量分别为1.93×105Da和1.07×105Da的超纯水洗脱组分WXA-1和AXA-1。药理实验结果表明，AXA-1对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用强于WXA-1，其中AXA-1对α-淀粉酶呈竞争性抑制，对α葡萄糖苷酶呈混合型非竞争性抑制。

4 结论

综上所述，聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl在多糖的分离纯化中发挥着重要作用。除大量应用于多糖类化合物外，Sephacryl还对肽类、激素类、蛋白、DNA片段等也有分离纯化的应用。当前研究中，Sephacryl不仅分离范围广，还具有多选择性和化学稳定性高等特性。再配备密封柱、加压泵、自动收集器甚至A KTA纯化系统等仪器设备，Sephacryl分离纯化系统具备更加完善的自动化机械性能，不仅扩充了其使用领域，还优化了纯化效果。Sephacryl凝胶系列的广泛使用为活性多糖的构效关系研究、药效机制研究提供更加有效可靠的分离纯化工艺，对多糖分离纯化方法的革新也起到较好的促进作用。