春尺蠖可溶性海藻糖酶AcinTre1A和AcinTre1A-like基因的克隆及饥饿胁迫下表达谱

陈 龙， 董飞龙， 王 建， 查 干， 崔阔澍， 马杰茹

(1.河套学院农学系，内蒙古巴彦淖尔 015000； 2.内蒙古磴口县林业和草原有害生物防治检疫站，内蒙古巴彦高勒 015299；3.内蒙古乌拉特前旗草原工作站，内蒙古乌拉特前旗 014407； 4.内蒙古巴彦淖尔市草原工作站，内蒙古巴彦淖尔 015000；5.四川省农业技术推广总站，四川成都 610041)

海藻糖作为一种非还原性双糖，是大部分昆虫体内的主要糖类物质，它存在于除哺乳动物之外的其他生物，如细菌、酵母、真菌、线虫、植物、昆虫和其他无脊椎动物等[1-4]。海藻糖不仅可以作为储存库储存碳水化合物，同时还可以保护蛋白质以及细胞膜不受外界不利环境的刺激[5-8]。海藻糖的生产与利用还会受到极高或极低温度、干燥、渗透/氧化应激和静水压力变化以及营养缺乏导致的细胞损伤的干扰[9]。此外，当昆虫处于饥饿环境中，海藻糖可作为能源物质提供能量[8]。

海藻糖酶是调节昆虫体内海藻糖的关键酶，是唯一可以水解海藻糖的酶，遍布于昆虫的各个组织，可将海藻糖分解为2分子的葡萄糖[7]。根据海藻糖酶是否存在跨膜结构，可将昆虫海藻糖酶分为可溶性海藻糖酶(soluble trehalase，TreS或 Tre1)和膜结合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase，TreM 或 Tre2)[10]。可溶性海藻糖酶分解细胞内的海藻糖，而膜结合型海藻糖酶分解胞外(主要为食物中)的海藻糖[11]。昆虫可溶性海藻糖酶基因和膜结合型海藻糖酶基因分别在黄粉虫(Tenebriomolitor)[12]和家蚕(Bombyxmori)[13]中首次克隆获得。此外，在西方蜜蜂(Apismellifera)，甜菜夜蛾(Beetarmyworm)和竹蠹螟(Omphisafuscidentalis)等其他昆虫中也发现了这2种海藻糖酶基因[14-16]。海藻糖酶基因在昆虫各个组织中均有分布，诸如肌肉相关组织、肠道和马氏管等[17-21]。相关研究表明，海藻糖酶不仅能水解海藻糖为葡糖糖，为昆虫生长发育提供能源，而且能调控几丁质代谢并控制蜕皮过程从而影响昆虫发育[22-25]。然而，在短期饥饿期间体内海藻糖酶基因的调节机制尚不清楚[19]。

春尺蠖(Apocheimacinerarius)隶属于鳞翅目、尺蛾科杂食性昆虫。该虫在我国多个省(市)自治区危害牧草、林木和经济树种[26，27]，在内蒙古自治区主要危害柠条。近些年，春尺蠖的危害对象逐渐由杨树、桑树、柳树、柠条以及经济类果树等林木扩散至玉米和小麦等大田作物，区域也由北部地区的内蒙古及新疆向四川、云南等南部地区扩散危害。幼虫最早于4月上旬开始发生危害，4龄幼虫在荒漠化草原中生存需要很强的耐饥饿能力，春尺蠖4龄幼虫能在如此环境中生存下来且发生危害，与其极强的耐饥性密切相关。为了深入了解海藻糖酶基因在春尺蠖应对饥饿胁迫中的作用，本研究利用已测春尺蠖4龄转录组数据，基于测序所得基因序列信息，结合NCBI BlastP和RT-PCR技术克隆获取2个海藻糖酶基因，分析其序列分子特征及氨基酸理化性质，同时对其序列进行比对并构建系统进化树，并分析其在不同时间饥饿胁迫下的表达谱，以期明确海藻糖酶基因在春尺蠖应对饥饿胁迫中的作用，为进一步揭示春尺蠖响应饥饿胁迫的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫及样品处理

将2021年春季于内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗柠条草场(108°45′23.63″E，40°46′4.19″N)采集的春尺蠖雌雄成虫带回实验室在室温下雌雄配对，以柠条锦鸡儿饲喂，待其产卵后放置于上海智城(ZXQP-R1700)人工气候箱中孵化，孵化条件[温度(22±1) ℃，光—暗周期18 h—6 h，相对湿度55%～59%]，孵化后的1龄幼虫以幼嫩柠条芽苞饲喂，待幼虫发育至4龄，选取4龄幼虫(蜕皮后2 d)分别进行不同时间的饥饿处理(0、6、24、72 h)，以 0 h 为对照(CK)，每个处理3个生物学重复，每个重复3头，将处理后的昆虫用液氮速冻，储存于 -80 ℃ 冰箱备用。

1.2 主要试剂

供试昆虫的RNA提取、反转录以及后续克隆PCR Master Mix、DNA胶回收试剂盒等均采购于大连宝生物有限公司；大肠杆菌感受态细胞DH5α则购自于北京天根生化科技有限公司。

1.3 RNA的提取及cDNA第1链的合成

将“1.1”节处理的供试样品从-80 ℃超低温冰箱中取出，放置于已灭菌且预冷的研钵中研磨，RNA提取步骤则参照宝生物公司的RNA提取试剂盒说明书，将提取后的RNA用Nano PhotometerTMP-Class超微量分光光度计检验浓度，使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测检测提取RNA的质量，待浓度和质量符合试验要求后反转录合成第1链。

1.4 春尺蠖海藻糖酶基因的克隆

本研究基于本实验室前期测序完成的春尺蠖4龄幼虫不同饥饿时间的转录组数据，结合转录组差异分析结果，筛选出2条具有完整CDS的海藻糖酶基因。基于序列信息与BlastP验证结果，利用Primer Premier 5.0软件设计引物扩增CDS区域。选择上述处理中PCR扩增条带最亮的样本为cDNA模板。AcinTre1A扩增正向引物(F)：5′-C T C T C C G A T T G C A T G G T T C T A C T T A-3′；反向引物(R)：5′-A T T T A T C T T A T T T A T G A C G C A C G T A T A-3′。AcinTre1A-like扩增正向引物(F)：5′-T G C T T G C T G T C T G C T A C C A T G T G A C-3′；反向引物(R)：5′-C G A T C G T C T C C C A T A C G T G C A G A T T-3′。目的基因克隆利用RT-PCR反应，反应体系为 25 μL，其中包括目的基因扩增模板1 μL，正向/反向引物各1 μL，PCR原料Master Mix 12.5 μL，其余体积用无酶水(RNase-free Water)补充至25 μL。反应条件：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃/68 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的扩增片段，而后切胶回收利用塔克拉的DNA胶回收试剂盒进行回收，待检测合格后，与克隆载体pMD-19T连接，随后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中转化，最后进行蓝白斑筛选和菌液PCR扩增，选取符合条件的菌落在液体培养基连夜培养12～16 h后送华大基因测序。

1.5 春尺蠖海藻糖酶基因的生物信息学分析

基于在线预测工具ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对春尺蠖海藻糖酶基因的蛋白编码区进行搜索。使用在线预测工具ExPASy-ProtParam tool(http：//web.expasy.org/protparam/)来预测春尺蠖海藻糖酶基因编码氨基酸的基本理化性质；使用DNAMAN 6.0软件分析春尺蠖及其他鳞翅目昆虫的海藻糖酶基因及其类似基因氨基酸的序列一致。利用SignalIP4.1(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1)在线预测工具对春尺蠖海藻糖酶氨基酸N端信号肽进行预测；蛋白跨膜区域则采用在线预测网站TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行预测；磷酸化位点和糖基化位点预测则分别选用在线预测网站NetPhos 3.1 Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和DictyOGlyc1.1在线预测(http：//www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)。系统进化树构建则选用MEGA 6.0，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)、P距离(P-distance)，重复运算1 000次。

1.6 春尺蠖海藻糖酶基因饥饿胁迫下的表达

为探究海藻糖酶基因在春尺蠖饥饿胁迫下的表达模式，本研究以前期测序获取的转录组数据为基础，基于转录组数据中的FKPM(Fragment Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)值，对春尺蠖AcinTre1A和AcinTre1A-like基因的表达情况进行分析。

1.7 数据统计与分析

整理完成春尺蠖AcinTre1A和AcinTre1A-like基因表达数据后，利用SPSS17.0软件进行统计分析，具体方法为单因素方差分析中的Duncan’s多重比较来分析基因表达量。研究结果则利用GraphPad Prism 7.0绘制柱形图，结果用“平均值±标准误”表示，显著水平为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 春尺蠖海藻糖酶基因的克隆与序列分析

基于春尺蠖4龄幼虫转录组中春尺蠖海藻糖酶基因序列，设计目的基因扩增引物后经1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳对产物检测，发现在1 919、2 412 bp处各出现1条单一、特异性条亮带，经测序后与转录组中基因序列信息比对，序列信息完全一致(图1、图2)，分别对其命名为AcinTre1A(基因登录号：OL512971)和AcinTre1A-like(基因登录号：OL512972)。

春尺蠖AcinTre1A与AcinTre1A-like基因编码蛋白理化性质预测结果表明，春尺蠖AcinTre1A与AcinTre1A-like基因序列CDS全长分别为1 803、1 746 bp，分别编码601、582个氨基酸，预测分子式分别为C3 122H4 716N806O934S16和C3 037H4 620N800O856S14，蛋白的预测分子量分别为68.99、66.48 ku，理论预测等电点分别为4.95、6.08；半衰期均为30 h，脂肪指数分别为79.71、84.81，负电荷残基(Asp+Glu)总电荷分别为93、71，正电荷残基(Arg+Lys)总电荷分别为62、66；该蛋白的亲水性系数分别为 -0.516、-0.359，均为亲水性蛋白。N端氨基酸均为蛋氨酸(Met，M)，预测不稳定系数值分别为41.51、37.56，由于AcinTre1A的不稳定系数大于40，故其为不稳定蛋白，而AcinTre1-like的不稳定系数小于40，所以该蛋白为稳定蛋白。信号肽检测结果均发现2基因均含信号肽，其中AcinTre1A在N端含1条25个氨基酸(M L K I R V P R F V P L Y P V L G L L G A C A Q A)的信号肽(图3-A)，AcinTre1A则含1条18个氨基酸(M K H L L L V V L A A A A V V T D D)的信号肽，均未发现跨膜结构。此外，具有2个海藻糖酶超家族保守结构域分别位于第27～551位和第27～562位氨基酸。磷酸位点检测在AcinTre1A与AcinTre1A-like中分别发现丝氨酸26、22个，苏氨酸16、11个，酪氨酸13、15个(图4)；检测各发现1个糖基化位点(图5)。

2.3 春尺蠖海藻糖酶基因的同源性比对及系统进化关系分析

由图6可见，春尺蠖AcinTre1A、AcinTre1A-like与其他鳞翅目昆虫的氨基酸整体一致性为67.79%，其中AcinTre1A与AcinTre1A-like之间的一致性仅为46.08%。春尺蠖AcinTre1A与灰斑霜尺蠖Apocheimapilosaria的一致性最高，为88.54%，其次为尺蛾科的双齿贡尺蛾Odontoperabidentata和天蛾科的烟草天蛾Manducasexta，分别为78.07%、62.96%；AcinTre1A-like与烟草天蛾、艺神袖蝶Heliconiuserato和大蜡螟Galleriamellonella也均保持较高的一致性，分别为79.21%、71.48%、68.10%。

从春尺蠖与其他鳞翅目昆虫海藻糖基因及其类似物的系统进化树(图7)可以看出，总体来看，海藻糖酶基因与其类似基因分别聚在2个分支上，春尺蠖的2个基因也聚在各自的大分支中；春尺蠖AcinTre1A与同为尺蛾科的灰斑霜尺蠖Tre1A聚为一类，AcinTre1A-like与天蛾科的烟草天蛾聚为一类；斜纹夜蛾Spodopteralitura与草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda的Tre-like在系统进化树中与其他昆虫的Tre更近，说明这2个类似基因与Tre基因序列更加相似，功能更为相近。

2.4 春尺蠖海藻糖酶基因饥饿胁迫下的表达分析

从图8可知，春尺蠖AcinTre1A和AcinTre1A-like基因随着饥饿处理时间的增加，表达量逐渐降低，AcinTre1A-like下降速度较缓，而AcinTre1A则下降较快；除处理6 h外，与对照相比，其余处理时间基因表达量均呈显著差异(P<0.05)。

3 讨论与结论

本研究从已有转录组数据库中筛选出2条差异的海藻糖基因，通过BlastP的进一步验证，基于验证序列信息与RT-PCR技术成功获取上述基因的蛋白编码区。蛋白结构预测中均未发现有跨膜结构，却均含信号肽，符合可溶性海藻糖酶基因的特征[10]。此外，BlastP的比对结果中发现多个可溶性海藻糖酶基因，同时序列比对中与其他昆虫的海藻糖酶基因的一致性均分别在62.96%、68.10%以上，最高分别达88.54%、79.21%。综上所述，将春尺蠖2个海藻糖酶基因鉴定为可溶性海藻糖酶基因，并命名为AcinTre1A、AcinTre1A-like。

生物信息学分析结果表明，AcinTre1A、AcinTre1A-like基因序列CDS全长分别为1 803、1 746 bp，分别编码601个和582个氨基酸，蛋白的预测分子量分别为68.99、66.48 ku，理论预测等电点分别为4.95、6.08，与大多数昆虫的海藻糖酶基因及其类似基因相似。AcinTre1A与AcinTre1A-like基因均有1条信号肽，但无跨膜结构，说明其可能是非膜相关蛋白[28]，符合海藻糖酶基因作为分泌蛋白需要游离至胞外发挥作用的特征。2个基因均含磷酸位点，推测其可能参与昆虫体内的信号转导过程[29]。从序列比对结果可以看出，AcinTre1A相较于AcinTre1A-like基因长度略长，这可能导致在系统进化分析中聚类的原因之一。但发现斜纹夜蛾和草地贪夜蛾的Tre-like基因与Tre基因分支聚为一类，与Tre基因相比，其亲缘关系较其他昆虫的Tre-like更近，说明这2个类似基因在序列结构和功能上与Tre基因更为相似。

相关研究表明，海藻糖酶基因在抵抗外界不利因素和能量调节方面发挥重要作用[30-31]。如在外界处于干旱时，黑腹果蝇Drosophilamelanogaster体内的海藻糖酶活性下降，升高的海藻糖可作为保护因子来帮助昆虫清除由干旱产生的活性氧[32]。在异色瓢虫Harmoniaaxyridis的研究中发现，HaTreh1-1是可调节能量代谢并提供葡萄糖的关键基因，而HaTreh1-2在该虫饥饿期间可与HaTPS协同来调节海藻糖，使其处于平衡动态状态[19]，在步甲Merizodussoledadinus成虫中也发现该虫在食物匮乏期间显著增加了糖和甘油三酯的水解，用以虫体供能[33]。在本研究中，随着饥饿处理时间的增加AcinTre1A和AcinTre1A-like基因的表达量逐渐降低。随着饥饿时间的增加，体内海藻糖酶下降以保留更多的海藻糖用来抵御外界不利环境，同时前期海藻糖酶分解了足够多的物质，所以能量足以满足机体所需，所以海藻糖酶呈现下降趋势，说明AcinTre1A和AcinTre1A-like可能在虫体能量不足时的能量补给源，还可调节机体海藻糖含量用来抵御外界的不利环境。

本研究中已完成对AcinTre1A和AcinTre1A-like的克隆和鉴定以及蛋白理化性质的分析等，此外还分别对基因的序列与系统进化关系进行了分析，明确了其在饥饿胁迫的表达水平，但是还有相关问题待进一步明确。(1)本研究虽然对春尺蠖海藻糖酶基因进行在不同饥饿时间的表达谱分析，但是还缺乏组织表达分析，由于2种海藻糖酶在组织表达谱上也有区别，组织表达水平的研究可进一步确认基因类型，同时还可进一步明确海藻糖酶发挥作用的精确位置，为后续的功能研究奠定一定的基础。(2)不同饥饿处理的时间间隔略长，无法观测到海藻糖酶基因的渐变过程，后期应细化饥饿处理时间间隔，以期全面把握基因表达的动态变化，为后续相关研究的开展提供依据。(3)在春尺蠖转录组中发现了可溶性和膜结合型海藻糖酶2种类型，本研究只针对可溶性海藻糖酶基因进行研究，后期研究膜结合型海藻糖酶，以期更加系统全面地明确春尺蠖在饥饿胁迫中海藻糖代谢及抵御饥饿胁迫的分子机制。此外，海藻糖的调控过程与海藻糖合成酶TPS密切相关，可平衡海藻糖在体内的含量，二者协同作用有待于进一步研究。

本研究克隆获取了2条海藻糖酶基因，明确了其理化性质、序列特征及系统进化关系，同时分析了其在不同饥饿胁迫下的表达水平。研究结果表明，春尺蠖春尺蠖海藻糖酶基因AcinTre1A和AcinTre1A-like属于可溶性海藻糖，春尺蠖在饥饿胁迫下AcinTre1A和AcinTre1A-like可被诱导表达，研究结果有助于为今后开展海藻糖酶基因在春尺蠖抵御饥饿胁迫的功能以及分子机制的研究奠定基础。