AKT2 rs3730051、AKT2 rs969531基因多态性与广西地区人群ANCA相关性血管炎的关联性

李柔 薛超 黎伟 饶金兰

(广西医科大学第二附属医院肾内科，广西 南宁 530007)

原发性抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)是一组以小血管坏死性炎性损伤和纤维素样坏死为特征的自身免疫性疾病，可致肾脏、肺脏等全身多器官损害，现已成为较常见的自身免疫性疾病之一，疾病病情复杂多变，发病高峰在65～74岁，有数据统计约50%患者在治疗缓解后的5年内仍复发〔1〕。AAV发病机制尚未完全阐明，目前已证实遗传因素参与ANCA相关性血管炎的发病过程中〔2〕，同时环境、药物、感染等可能是重要诱因共同导致AAV的发生。AKT又称作蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， AKT参与多条细胞信号通路，其中最重要作为磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的核心下游分子在机体中发挥作用。PI3K-AKT信号通路广泛存在细胞中，PI3K活化后催化AKT磷酸化，引起信号通路的级联反应，进一步磷酸化糖原合成酶激酶(GSK)-3、叉头框蛋白(Fox)Os、B细胞淋巴瘤-2(Bad)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)9、核转录因子(NF)-κB、哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)及P21 等多种蛋白，介导细胞生长、增殖、细胞周期调节及糖代谢调节等多种活动〔3〕。目前已有研究表示PI3K-AKT信号通路与肿瘤、自身免疫性疾病、肾脏相关疾病发生和病理进展密切相关〔4，5〕。笔者推测PI3K-AKT信号通路可能参与AAV发病及疾病发展过程中，AKT是PI3K下游的关键蛋白，其中AKT2作为同工酶之一，在肿瘤和糖尿病中发挥重要作用〔6,7〕。目前AKT2在ANCA相关性血管炎中遗传学意义尚不明确，本研究旨在探讨AKT2 rs3730051、rs969531基因多态性与广西地区人群ANCA相关性血管炎的关联性。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2005年1月至2018年12月于广西医科大学第二附属医院住院及门诊确诊为AAV的215例患者为AAV组，其中男82例，女133例，平均年龄(54.44±14.9)岁。对照组收集同期于体检中心体检的性别、年龄相仿的健康人群201例，其中男79例，女122例，平均年龄(52.21±11.87)岁。两组平均年龄(t=1.691)及性别构成(χ2=0.059)差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。研究对象籍贯均为广西，本研究已获得广西医科大学伦理委员会的批准及全体纳入对象的知情同意。纳入标准：参照2018年增编的2012年Chapel Hill国际血管炎命名会议的标准。排除标准：排除继发性小血管炎及合并多器官功能障碍、肿瘤、其他自身免疫性疾病、妊娠的患者。

1.2资料收集 收集纳入患者的一般资料、临床资料、实验室资料。一般资料包括：年龄、性别。临床资料包括：血尿、发热、咳嗽、水肿、皮疹、关节痛、肌肉痛、咯血、体重下降(≥5 kg/30 d)等症状。实验室资料包括：血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血脂四项、尿蛋白定量及定性、空腹血糖、自身抗体、ANCA抗体、C反应蛋白(CRP)、血沉、抗链球菌溶血素(ASO)、类风湿因子(RF)、补体、胸片、肾脏穿刺病理结果。

1.3外周血收集和基因组DNA提取 使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集所有研究对象外周静脉血2 ml，采用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，严格按照说明书步骤提取外周血基因组DNA。

1.4基因分型 采用多重聚合酶链反应(PCR)扩增结合高通量测序方法，由生工生物工程(上海)有限公司完成基因分型。具体步骤：设计并合成好一个包含本研究中AKT2 rs3730051、rs969531位点的引物池，然后通过两步PCR的方法完成目标单核苷酸多态性(SNP)位点序列的扩增和兼容Illumina测序文库的制备。第一轮PCR体系如下：DNA 模板(10 ng/μl) 2 μl;上游引物池(10 μmol/L)1 μl;下游引物池(10 μmol/L) 1 μl;2×PCR Ready Mix 15 μl(总体积 25 μl)(Kapa HiFi Ready Mix)。配制好反应体系后，在PCR仪(BIO-RAD，T100TM)上执行以下反应程序：98℃预变性3 min，然后执行8个循环，条件是98℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s。紧接着执行25个循环，条件是98℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s。最后72℃延伸5 min。反应完成后，4℃保存反应产物。PCR完成后，使用1%的琼脂糖胶电泳检测PCR产物，确定产物大小正确，使用AMPure XP磁珠纯化回收PCR产物。然后以第一轮PCR产物为模板执行第二轮PCR反应，以获得测序带分子标签的文库。反应体系如下：DNA模板(10 ng/μl) 2 μl，通用P7引物(含分子标签，10 μmol/L)1 μl;通用P5引物(10 μmol/L) 1 μl;2× PCR Ready Mix 15 μl(总体积30 μl)。配制好反应体系后，执行如下PCR程序：98℃预变性5 min，然后执行5个循环程序，变性94℃ 30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，最终72℃延伸5 min。完成后4℃保存反应产物。最终PCR产物使用AMPure XP磁珠纯化回收。各个PCR产物等量混合后，使用HiSeq XTen测序仪(Illumina,San Diego,CA)进行测序。

1.5统计学分析 采用SPSS19.0软件和SHEsis在线软件进行独立样本t检验、方差分析、χ2检验和Logistic回归分析。非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距表示，采用秩和检验。Hardy-Weinberg平衡吻合度检验以P>0.05表示群体具有代表性。

2 结 果

2.1各SNP位点基因型及等位基因频率的分析 两组样本在rs3730051、rs969531位点上基因型、等位基因分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明研究对象具有群体代表性。AAV组与对照组AKT2 rs3730051、rs969531基因型及等位基因分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2AAV组各基因型间临床症状比较 在AAV组215例患者中采集到185例患者的临床症状，根据体重下降、发热、咳嗽、水肿、关节痛症状发生频率，分别在各个位点的基因型间进行对比，发现rs3730051位点基因型频率在AAV患者中伴体重下降和不伴体重下降亚组中分布差异有统计学意义(P<0.05)。在AAV组中，以rs3730051位点基因型为自变量，是否出现体重下降症状为因变量进行Logistic回归分析，以CC+TC基因型为参照(OR=1)，发现携带TT基因型出现体重下降症状的风险是CC+TC基因型的3.043倍(OR=3.043，OR95%CI=1.43～6.45；P=0.003)。见表2、表3。

表1 AKT2 rs3730051、rs969531基因型和等位基因分布频率比较〔n(%)〕

表2 AAV组rs3730051、rs969531位点各基因型在临床症状亚组的对比〔n(%)〕

2.3AAV组各基因型实验室检查比较 对AAV组中白细胞计数、中性粒细胞计数、三酰甘油、胆固醇、空腹血糖实验室指标分别在各个位点的基因型间进行对比，发现rs3730051位点白细胞计数在AAV患者各基因型中分布差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 AAV组rs3730051、rs969531各基因型实验室指标的对比〔M(P25，P75),n=215〕

3 讨 论

AAV以多脏器受累为常见表现，自然病程死亡率高，预后差，影响预后的关键因素为早期诊断、早期及合理使用糖皮质激素和(或)免疫抑制剂治疗。为提高AAV的诊断水平和治疗效果，需尽快阐明其发病机制，争取在病因水平上进行预防及治疗。其中遗传因素在AAV的发病机制中起重要作用，AKT2位于人类染色体的19q13.2，为AKT的一种重要亚型， AKT2影响细胞增殖，在早期囊胚增殖和胚胎发育中必不可少〔8〕。AKT2持续活化与肿瘤密切相关， AKT2在肺癌〔9〕、肝细胞癌〔10〕、结肠癌〔11〕、卵巢癌〔12〕、乳腺癌〔13〕等多种肿瘤组织有过度表达或活化，并与肿瘤增殖、侵袭、转移及预后相关。在免疫系统中，AKT2参与体液反应，通过调节CD19磷酸化，促进B细胞受体(BCR)信号通路和肌动蛋白重塑，增强B细胞的活化〔14〕。目前B细胞抑制剂利妥昔单抗对AAV治疗疗效逐渐证实， AKT2可能通过影响B细胞活化参与AAV发病机制。AKT2可影响辅助性T细胞(Th)及调节性T细胞(iTreg)的分化及功能，AKT2可以促进Th-17亚群的分化及影响外周CD4 T细胞的功能〔15〕。Qiao等〔16〕发现AKT2通过Foxo1/Foxo3a依赖的方式参与抑制iTreg的生成。Ouyang等〔17〕发现敲除AKT2小鼠出现严重的自身免疫性脑脊髓炎，这与tTreg增殖缺陷和Th1/Th17反应升高有关。Th17/Treg失衡在AAV发病机制中扮演着重要角色。Abdulahad等〔18〕发现在AAV患者外周血中Th-17和白细胞介素(IL)-17A水平升高，并普遍存在以Th-17为主的Th细胞的异常分化，从而导致靶器官的损害〔19〕。在AAV患者活动期中检测到Treg细胞数量减少、功能受损〔20〕，疾病进展可能与CD4 T细胞数量的增加相关。根据上述分析，AKT2可能参与通过T细胞免疫影响AAV发病及疾病进展。目前AKT2与AAV疾病的关联性尚缺乏研究，因此推测AKT2 rs3730051、rs969531基因多态性是否与AAV的发生发展相关。本研究结果提示，所选择的AKT2 rs3730051、rs969531位点可能与广西人群AAV的遗传易感性无关。目前关于该两位点研究尚少，仅有单项研究发现AKT2 rs3730051与多囊卵巢综合征发病相关〔21〕，一项国内小样本研究发现AKT2 rs3730051突变能增加冠心病的发病率〔22〕。PI3K/AKT信号通路对免疫细胞的募集及活化的调控具有重要作用，已有研究提示在多种炎症疾病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、多发性硬化症等疾病病程中发挥着重要作用〔4〕，但该通路的基因多态性与自身免疫性疾病关联性研究甚少，需进一步探索。

本研究发现，AKT2 rs3730051位点携带TT基因型发生体重下降的风险较TC+CC基因型高。AKT2是维持正常葡萄糖稳态的重要基因，AKT2通过葡萄糖转运蛋白(GLUT)及GSK等多种底物影响糖代谢。AKT2对胰岛素抵抗和糖尿病发病起重要作用，研究证实缺乏AKT2基因的小鼠对胰岛素有抵抗，同时胰岛素抑制葡萄糖产生的能力被完全清除〔23〕。在严重胰岛素抵抗的患者体内发现有AKT2基因的突变〔24〕。在脂质代谢中，PI3K/AKT通路通过抑制 Foxo1 的磷酸化而解除对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的活性抑制，从而促进成脂过程〔25〕。其中有研究表示干扰AKT2较干扰AKT1明显抑制成脂分化过程，提示可能为AKT2参与上述过程〔26〕。笔者推测AKT2 rs3730051位点可能影响AKT的下游底物进而影响糖代谢、脂质代谢通路，造成机体代谢紊乱导致体重下降发生，但在本研究中对病例组中两位点的各基因型总胆固醇、三酰甘油、血糖指标进行对比未见明显差异，考虑可能与营养结构、疾病进展状态程度不同，故该影响机制尚待进一步研究。

本研究对实验室资料分析显示，在AAV组rs3730051位点各基因型携带TT基因型的白细胞计数偏高。AKT2可调控巨噬细胞的极化影响炎症反应，Wu等〔27〕发现在牙周炎患者中过表达AKT2可以诱导M1巨噬细胞极化，降低M2极化，还可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，进而增加促炎介质的释放。小血管的炎性损伤是AAV的基本特征，笔者推测在rs3730051位点携带TT基因型时AKT2基因活性较高和功能较活跃，促进白细胞升高并影响巨噬细胞极化，促进炎症反应的发生。但该亚组白细胞计数平均值在正常范围内，该结果需辨证看待。

综上，AKT2 rs3730051、rs969531基因多态性与广西人群AAV遗传易感性无关，AKT2 rs3730051基因多态性与AAV患者体重下降相关，AKT2 rs3730051基因多态性影响AAV患者的白细胞水平。但由于本研究样本量较小和地域局限，目前对AKT2基因多态性研究尚少，上述结论需进一步扩大样本量及进行多区域、多位点研究。