臭氧水疗法对KOA大鼠关节软骨及Wnt/β-catenin信号通路的影响

丁小芬 周友龙 田明月 韩松辰 贾梦雅 李彦华 杨志孟 王晶

(河南中医药大学第三临床医学院，河南 郑州 450008)

膝关节骨性关节炎(KOA)是一种关节退行性疾病，临床常见于中老年人，其主要病理特征为进行性关节软骨退化，膝关节退变由衰老、肥胖、外伤、关节不稳、过度使用或其他异常负荷引起〔1〕，临床症状常包括关节肿胀、疼痛、活动受限、关节畸形等。KOA是引发全球患病老年人口慢性疼痛和导致残疾的主要原因〔2～4〕，在60岁以上人群中影响多达1/3以上〔5〕。西医治疗该病易出现不良反应，中医治疗起效较慢，周友龙等〔6～8〕采用中西医结合疗法，运用臭氧水关节腔联合穴位注射治疗KOA，可有效缓解疼痛、改善关节活动度、创伤小、无明显毒副作用、疗程短、疗效确切。

KOA的发病机制比较复杂，近年来，学者们发现调控关节形成和内环境稳态的众多信号通路是导致KOA发病的关键因素，其中经典通路Wnt/β-catenin信号通路被认为是重要的通路之一〔9,10〕，炎症环境下该通路被激活，下游靶基因基质金属蛋白酶(MMPs)过度表达，导致细胞外基质过度降解，关节软骨破坏〔11,12〕。本实验通过关节腔注射木瓜蛋白酶建立KOA大鼠模型，基于Wnt/β-catenin信号通路探讨臭氧水关节腔联合穴位注射治疗KOA的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物:3月龄SPF级雄性SD大鼠48只，体重(300±20)g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物许可证号：SCKX(鲁)20190003，在河南中医药大学实验动物中心常规饲养，1 w后用于模型制备。主要试剂:木瓜蛋白酶、左旋半胱氨酸(批号：SLCD866、STBJ3975)购于美国Sigma-Aldrich公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(批号：20200817)购于北京索莱宝科技有限公司；β-catenin、Wnt3a、MMP-13抗体(批号：A19657、 A13601、A11148、A2562)购于美国ABclona公司；GAPDH抗体(批号：60004-1-lg)购于武汉三鹰生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒(批号：20200522)购于北京索莱宝科技有限公司；逆转录试剂盒(批号：00753607)购于美国Thermo Fisher公司；2X通用型SYBR Green快速定量聚合酶链反应(qPCR)预混液(批号：9619031126)购于美国ABclona公司。主要仪器:医用臭氧水制备仪(型号：SYZ-80A)购自济南三氧科技有限公司；病理切片机(型号：RM2016)上海徕卡仪器有限公司；全波长酶标仪、离心机、核酸蛋白浓度微量测定仪(型号：Multiskan GO、ST16R、Nanodrop 2000)购于美国Thermo Fisher公司；荧光定量PCR仪(型号：TL-988)西安天隆科技有限公司。

1.2分组与造模 将48只大鼠随机分为空白组(12只)和造模组(36只)，造模组分别在实验的第1、4、7天行关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液〔13〕：称量大鼠体重，常规碘伏消毒，术者戴无菌手套，用2 ml的注射器按大鼠体重按照剂量(5 ml/kg)的剂量抽取10%水合氯醛溶液，以45°斜刺进行腹腔注射麻醉，剪去大鼠右后膝关节周边1 cm区域的皮毛，屈曲大鼠右后膝关节45°，使用微量注射器按大鼠体重按照剂量(0.1 ml/kg)抽取木瓜蛋白酶溶液剂量，以髌骨下及髌腱外缘为进针点，向髁间窝方向进针，抵达股骨髁后回撤2 mm，将木瓜蛋白酶溶液推入即可。造模结束后空白组取1只、造模组取3只大鼠，分别处死取关节软骨组织进行苏木素-伊红(HE)染色，验证造模成功。再将造模组随机分为模型组、生理盐水组、臭氧水组，每组11只。

1.3实验干预 于最后1次注射木瓜蛋白酶3 w后开始干预，空白组、模型组采取同样抓取，不予治疗；臭氧水组向大鼠右膝关节腔内注射20 μg/ml的臭氧水0.2 ml，“梁丘”“血海”“阴陵泉”“阳陵泉”“三阴交”行穴位注射，每穴20 μl，1次/w，共治疗3 w；生理盐水组操作同臭氧水组，仅是把药物由20 μg/ml臭氧水换成0.9%生理盐水。

1.4样本取材及检测分析

1.4.1取材 采用颈椎脱臼法分别处死各组大鼠，将大鼠右膝关节处皮肤切开暴露皮下膝关节，被动弯曲膝关节，用手术刀切开髌下韧带，然后用镊子夹住髌下组织连同髌骨一起用力向上牵拉，再依次剪去关节周围其他组织和韧带，以充分暴露关节软骨。用刀片尽量切下股骨远端、胫骨近端的关节软骨。每组随机选取3只大鼠的右侧膝关节标本置于装有4%多聚甲醛的离心管中固定，进行病理切片的制作和观察；各组剩余8只大鼠的右侧膝关节标本，放入标好号码的冻存管用液氮保存，转运至-80℃冰箱，用于Western印迹和实时荧光定量(RT)-PCR检测。

1.4.2HE染色 取软骨组织脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋后制备软骨组织切片，参考HE染色试剂盒对切片进行染色，光镜下观察，并参照改良Mankin评分标准对各组关节软骨评分。

1.4.3Western印迹检测软骨组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白表达情况 取各组冻存的软骨组织，加入裂解液置于高速组织研磨仪上进来组织研磨，测定蛋白浓度后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胺电泳(SDS-PAGE)分离后转膜、封闭，采取Wnt3a、β-catenin、MMP-13、GAPDH一抗孵育聚偏氟乙烯(PVDF)膜，4℃过夜后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗与膜接触，室温振摇反应1 h，在暗室中，将膜浸入发光液显影，以GAPDH为内参，用凝胶图像处理系统分析Wnt3a、β-catenin、MMP-13各蛋白条带的灰度值。

1.4.4RT-PCR检测软骨组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-13 mRNA表达情况 将冻存的关节软骨解冻后将软骨削成碎屑状，按Trizol试剂盒说明提取总RNA，逆转录为cDNA，采用RT-PCR法检测Wnt3a、β-catenin、MMP-13 mRNA表达水平，选用GAPDH作为内参，反应程序为首先预变性95℃作用3 min；变性95℃作用15 s，退火60℃作用1 min，延伸72℃作用1 min，进行35个循环；引物由江苏金唯智生物科技有限公司合成。GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；Wnt3a上游引物：5′-CAGGGCACTAACAAGTCGGG-3′，下游：5′-CCACACTGGGCATGATCTCC-3′；β-catenin上游引物：5′-ACTCCAGGAATGAAGGCGTG-3′，下游：5′-GAACTGGTCAGCTCAACCGA-3′；MMP-13上游引物：5′-ACCCAGCCCTATCCCTTGAT-3′，下游：5′-TCTCGGGATGGATGCTCGTA-3′。利用2-ΔΔCt法分别计算出Wnt3a、β-catenin、MMP-13mRNA的表达量。

1.5统计学分析 采用SPSS21.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1HE染色结果 空白组关节软骨表面光滑，无缺损，四层结构(浅表层、过渡层、辐射层和钙化层)排列规则可见，无血管侵入，潮线完整，软骨细胞数量正常，软骨基质着色均匀；模型组关节软骨破坏严重、不完整，表面粗糙不光滑，有裂隙形成，四层结构紊乱，有血管侵入，潮线不完整，过渡层细胞紧密排列现象消失，软骨细胞变性数量减少、排列混乱、分布不均匀、呈簇状分布，可见软骨细胞凋亡现象，软骨基质着色不均匀；生理盐水组关节软骨表面粗糙，有少量裂隙形成，四层结构层次不清，潮线结构少量破坏，软骨细胞数量减少、排列不整齐，可见部分软骨细胞部分凋亡现象，软骨基质着色较均匀；臭氧水组：关节软骨表面较光滑，未见明显裂隙产生，四层结构层次清楚，潮线结构绝大部分完整、个别不完整，软骨细胞数量基本正常、排列整齐、分布较均匀，软骨基质着色均匀。见图1。

图1 各组软骨组织病理形态(HE染色，×200)

2.2光镜下对各组软骨组织病理切片行改良Mankin评分 与空白组〔(0.00±0.00)分〕相比，模型组〔(7.67±1.53)分〕、生理盐水组〔(5.00±1.00)分〕及臭氧水组改良Mankin评分〔(2.33±0.58)分〕均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，生理盐水组和臭氧水组评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与生理盐水组相比，臭氧水组评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3Western印迹检测软骨组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表达水平 与空白组相比，模型组、生理盐水组、臭氧水组软骨组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表达水平均增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，生理盐水组、臭氧水组软骨组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与生理盐水组相比，臭氧水组软骨组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表1。

图2 各组目的蛋白印迹

表1 各组软骨组织内Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表达

3 讨 论

KOA属于中医“痹症”范畴，在古代医案中有“骨痹”“鹤膝风”“历节”等类似该病的记载，主要病机特点为人体正气不足，肝肾亏虚为主要因素，风寒湿邪侵袭为诱发因素〔14〕。西医认为KOA与金属蛋白酶、细胞因子、激素水平、免疫因素、信号通路等多种机制综合作用有关〔15〕，其中，软骨细胞凋亡和软骨基质合成与降解之间的失衡是软骨变性和损伤的重要原因〔16〕，KOA发生时炎症因子表达上调，通过一系列信号转导将信号向下游传递，引发软骨退变。其中，已经证明Wnt信号通路是骨关节炎发展的关键〔17〕，Wnt/β-catenin信号通路是软骨发育和骨重塑的重要机制，通过信号转导诱导下游MMPs表达，导致关节软骨细胞外基质改变和软骨破坏，是调节关节炎发生发展的重要信号通路之一〔18〕。Wnt3a配体可与跨膜蛋白分泌型FZ相关蛋白(sFRP)上富含半胱氨酸的区域结合，激活经典Wnt信号通路〔19〕，β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路上的核心蛋白，在信号转导过程中起主导作用，β-catenin在细胞质中积累后可进入细胞核内参与转录，促进下游靶向介导的MMPs等的表达，尤其是MMP-13对Ⅱ型胶原的降解性较强，是促进软骨基质降解的关键酶，在软骨破坏中起核心作用〔20〕。

本研究采用关节腔内注射木瓜蛋白酶复制KOA大鼠模型，木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，通过将硫酸软骨素从关节软骨基质的蛋白多糖复合物中释放出来，导致关节软骨稳态无法维持，正常的应力也会造成软骨损伤而引起KOA，但对软骨细胞和胶原蛋白没有直接影响，不会干扰软骨组织的修复机制和修复能力〔21〕。本研究中生理盐水组有治疗作用是由于生理盐水组向大鼠“阴陵泉”“阳陵泉”“梁丘”“血海”“足三里”“三阴交”穴位内注射生理盐水，对穴位产生了刺激，发挥了穴位的治疗作用。袁佳梦〔22〕研究发现毫针刺KOA模型兔“犊鼻”“内膝眼”“梁丘”“血海”和火针刺“犊鼻”“内膝眼”治疗比较差异无统计学意义，发现通过对穴位的刺激可能抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导，关节软骨内β-catenin的表达被抑制，阻止了Wnt信号的传递，从而减少了下游MMP-3和MMP-13的表达，缓解关节软骨的退变。本研究结果显示，经臭氧水关节腔联合穴位注射干预后，对关节软骨保护作用明显，臭氧水作为一种强氧化剂，可诱导超氧化物歧化酶(SOD)过度表达，从而清除病理过程中产生的过多活性氧(ROS)，还能刺激抗炎因子的产生，改善关节内的炎症环境〔23〕，可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导，导致该通路的配体Wnt3a不能与跨膜蛋白有效结合，β-catenin不能在细胞质内聚集进入细胞核内，从而抑制下游靶基因MMP-13表达，抑制关节软骨内细胞外基质的降解，从而延缓关节软骨的破坏。

综上，Wnt/β-catenin信号通路在KOA大鼠关节软骨内被激活，阻止该信号通路的转导可以改善关节软骨的破坏。臭氧水关节腔联合穴位注射疗法可以改善KOA大鼠关节软骨病理评分，有效延缓关节软骨的退变，其作用机制可能是抑制正调节因子Wnt3a和β-catenin的表达，从而降低了下游靶基因MMP-13的表达，抑制了Wnt/β-catenin信号通路的转导，减少软骨细胞凋亡和细胞外基质降解，延缓关节软骨退变，这可能是臭氧水疗法治疗KOA的作用机制之一。