补阳还五汤含药血清对代谢相关脂肪性肝病细胞模型脂质沉积的作用

周凯旋 薛嘉宝 李丽静

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)是由于代谢性因素所导致的脂肪在肝细胞沉积过度，在学术上曾称为非酒精性脂肪性肝病，较多的发生于肥胖人员及糖尿病患者中〔1〕。Ⅱ型糖尿病是MAFLD发生的重要因素，通常这两种疾病可以共存，相互影响，使疾病的发生发展进程加剧〔2，3〕，近几年研究发现MAFLD与糖尿病、肥胖、高血压等多种代谢性综合征有着明显的关系，肝脏是胰岛素作用的主要靶器官，肝脏对血糖稳态的控制起着非常重要的作用，而MAFLD与糖尿病的共同病理特点是胰岛素的抵抗〔4，5〕，有调查研究显示，Ⅱ型糖尿病的患者有较高风险患MAFLD，若不能进行有效的控制治疗，可进一步发展成脂肪性肝炎、肝硬化，患者的生命健康会受到较为严重的影响〔6，7〕。在中医理论中的“消渴病”既是现代临床常说的糖尿病，而脂肪肝通常认为是“肥气病”“痰证” “胁痛”等中医药理论的范畴〔8〕，二者病因具有共同点，多为饮食不节、嗜食肥甘厚味、劳逸失度、情志失调所引起机体代谢失调，进而诱发疾病〔9〕，补阳还五汤是益气活血法的代表方，临床有较多案例将其应用于治疗糖尿病及其并发症〔10，11〕，补阳还五汤对血脂、胆固醇具有良好的降低作用。本研究探讨补阳还五汤对代谢相关脂肪性肝病细胞模型脂质沉积的调节作用。

1 资料与方法

1.1动物 雄性SD大鼠8只，重量180～220 g，SPF级，购于辽宁长生实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(辽)-2015-0001。

1.2细胞 人肝癌细胞(HEPG)2由国家实验细胞资源共享平台提供，培养于37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱中，细胞培养液条件为10%胎牛血清的DMEM高糖培养液。

1.3试剂与仪器 油酸标准品(A1802058，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；CCK-8试剂盒(KR675，日本同仁化学研究所)；胎牛血清(1861242，Gibco)；DMEM高糖培养基(AF29449021，Hyclone)；油红O染色液(20200710，南京建成生物工程研究所)；三酰甘油(TG)检测试剂盒(20200708，南京建成生物工程研究所)；磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)多抗隆抗体(67121-1-Ig，武汉三鹰生物)；β-肌动蛋白(Actin)多克隆抗体(66009-1-Ig，武汉三鹰生物)；蛋白激酶B(AKT)多克隆抗体(10176-2-AP，武汉三鹰生物)；核因子(NF)-κB多克隆抗体(10745-1-AP，武汉三鹰生物)；Beclin-1多克隆抗体(11306-1-AP，武汉三鹰生物)；Caspase-3多克隆抗体(19677-1-AP，武汉三鹰生物)；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠二抗(SA00001-1，武汉三鹰生物)；HRP标记羊抗兔二抗(RS0002，Immunoway)；超敏化学发光(ECL)检测试剂盒(B2202008，武汉三鹰生物)；酶标仪(EPOCH，Bio Tek)；荧光倒置显微镜(IX73，Olympus)。

1.4补阳还五汤含药血清制备 根据人鼠药物剂量换算关系表，补阳还五汤以70 kg成人每日剂量140 g，换算200 g大鼠剂量为140 g×0.018=2.52 g，再经换算得大鼠每日临床等效剂量为12.6 g/kg。动物适应性饲养3 d后，分为空白组4只，补阳还五汤低剂量和高剂量组各2只，以补阳还五汤的大鼠临床等效剂量12.6 g/(kg·次)及2倍临床等效剂量25.2 g/(kg·次)灌胃给药，早晚各灌胃1次，连续3 d，末次给药1 h后，腹主动脉采血，以3 000 r/min离心10 min，分离血清经56℃水浴灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装冻存于-80℃冰箱备用。

1.5油酸储备液配置 将油酸标准品加到99℃预热的氢氧化钠溶液中皂化，再10%牛血清白蛋白(BSA)溶液1∶1混合，即为50 mmol/L的油酸储备液，使用0.22 μm微孔滤膜过滤后分装，冻存-20℃冰箱备用。

1.6油酸对HEPG2细胞毒性实验 调整细胞密度3×104个/孔，接种于96孔板，油酸设置浓度梯度为50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L，每组设置6个复孔，给药24 h后，使用CCK8于450 nm检测吸光度(OD值)，计算细胞增殖活性，确定诱导细胞脂肪变的油酸浓度。

1.7补阳还五汤对脂肪变HEPG2细胞脂质沉积的作用

1.7.1细胞分组 细胞分为正常组(Nor组；含10%空白大鼠血清的DMEM高糖培养液)，模型组(Mod组；10%空白大鼠血清+100 μmol/L油酸的DMEM高糖+)，补阳还五汤低剂量(BHL组；10%补阳还五汤低剂量大鼠血清+100 μmol/L油酸的DMEM高糖培养液)，补阳还五汤高剂量(BHH组；10%补阳还五汤高剂量大鼠血清+100 μmol/L油酸的DMEM高糖)。

1.7.2细胞TG检测 按上述分组，每组5个复孔，细胞处理24 h后，弃掉旧培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞3次后加PBS 0.2 ml刮取细胞，冰水浴条件下超声破碎，使用TG试剂盒检测TG含量，二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，最后以每克蛋白浓度校正TG含量，单位为mmol/gprot。

1.7.3油红O检测脂质沉积 细胞处理24 h后，弃掉旧培养基，使用PBS洗3次，加入新配制的油红O溶液染色15 min。染色完成后加入PBS清洗细胞3次，加入水性封固剂，在显微镜下观察。

1.7.4Western印迹检测细胞PI3K、AKT、Beclin-1、NF-κB、Caspase-3蛋白表达 细胞总蛋白提取后使用BCA法测定蛋白浓度，使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳，70 V、30 min浓缩胶电泳，110 V、60 min分离胶电泳。电泳结束后75 V恒压湿转80 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，洗膜3次，二抗孵育1 h，洗膜3次，ECL发光法进行曝光。

1.8统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1油酸对HEPG2细胞的毒性 与正常组(0.83±0.05)比较，随着油酸50、100、200、400、800 μmol/L浓度升高，细胞的增殖活性逐渐降低(OD值分别为0.80±0.08、0.79±0.07、0.77±0.08、0.77±0.03、0.60±0.05，P<0.05,P<0.01)，结合显微镜下进行观察，在200 μmol/L浓度条件下，细胞内的脂质沉积颗粒较多，细胞形态严重变形，为防止后续实验中药物对严重损伤的细胞无法彻底发挥治疗作用，故选择100 μmol/L的油酸浓度进行后续造模。见图1。

2.2对细胞内TG含量影响 与Nor组〔(0.13±0.01)mmol/gprot〕相比，Mod组的TG明显增高〔(0.25±0.04)mmol/gprot,P<0.01〕，BHL、BHH组〔(0.23±0.02)、(0.18±0.01)mmol/gprot〕对TG均有降低作用，其中BHH组降低具有统计学差异(P<0.05)。

2.3对细胞内脂质沉积的影响 与Nor组相比，Mod组的脂质沉积增高，BHL、BHH组的脂质沉积均有降低，其中BHH组降低作用较好，见图2。

2.4对细胞PI3K、AKT、Beclin-1、NF-κB、Caspase-3蛋白表达影响 与Nor组相比，Mod组PI3K、AKT、Beclin-1蛋白表达明显降低，NF-κB、Caspase-3表达明显升高(均P<0.05)，与Mod组比较，BHL、BHH组PI3K、AKT、Beclin-1蛋白表达明显升高，NF-κB、Caspase-3表达明显降低，其中BHH组作用较好，见表1、图3。

图1 显微镜下观察细胞形态变化(×400)

图2 补阳还五汤含药血清对脂肪变HEPG2脂质沉积的影响(油红O染色，×400)

表1 补阳还五汤含药血清对蛋白表达的影响

图3 补阳还五汤含药血清对蛋白表达的影响

3 讨 论

PI3K与多种细胞功能相关，包括细胞生长、增殖、分化、迁移和细胞内运输，是胰岛素信号通路的关键组成部分〔12〕，AKT是PI3K-AKT信号通路的主要的下游分子，包括3种亚型：AKT1、AKT2和AKT3，其中AKT1在多种组织中普遍表达〔13〕，研究显示，激活PI3K-Akt通路，可明显改善高脂饮食动物的血脂及肝脏的病理变化〔14〕。NF-κB是一种快反应转录因子，由p50/p65构成的异二聚体，可被包括PI3K-AKT信号通路的多种因素所调控〔15〕，临床研究表明，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者NF-κB的活性亦明显上升，提示NF-κB在NASH的损伤过程中扮演了重要角色，这其中的发病机制可能是因为NASH病程中出现脂质过氧化，激活了NF-κB〔16〕，NF-κB是一种具有多向性调节作用的蛋白质因子，不仅可介导肿瘤坏死因子α及白细胞介素6等多种炎性递质转录表达，还通过调控凋亡相关蛋白表达参与细胞凋亡的调控〔17〕。自噬是细胞利用溶酶体降解身受损细胞器和大分子物质的过程，是一种调节良好的细胞内代谢机制，以维持细胞在压力下的生存〔18〕，肝脏富含溶酶体，并具有高水平的代谢应激诱导自噬，它参与代谢相关脂肪性肝病的发生发展，脂质可通过选择性自噬(称为脂噬细胞)分解，肝细胞自噬发生障碍可以引起氧化应激和炎症的增加，导致肝脏疾病的进一步发展〔19,20〕。Beclin-1可以介导自噬体膜的形成，该蛋白与PI3K和Akt发生相互作用，提高机体的自噬水平〔21〕，通过提高自噬水平，可以达到对MAFLD的治疗作用〔22〕。

本研究表明补阳还五汤可以通过调节PI3K-AKT信号通路，影响肝细胞内的炎症反应，调节细胞的凋亡。本研究通过实验研究，证实了补阳还五汤对代谢相关脂肪性肝病的治疗潜力，也为中药的降脂新药研发提供了一定的思路。